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Fluoreszenzspektroskopische und -mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von Poly(ADP-ribose) mit Proteinen

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LÖFFLER, Tobias, 2020. Fluoreszenzspektroskopische und -mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von Poly(ADP-ribose) mit Proteinen [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Loffler2020Fluor-50994, title={Fluoreszenzspektroskopische und -mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von Poly(ADP-ribose) mit Proteinen}, year={2020}, author={Löffler, Tobias}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

deu 2020-09-23T09:35:18Z Löffler, Tobias Unsere DNA ist mannigfaltigen Umwelteinflüssen ausgesetzt, die sie beschädigen können. Die Reparatur dieses Bauplans des Lebens ist für alle Lebewesen ein essenzieller Prozess. Die Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen und die damit verbundene posttranslationale Modifikation, die Poly-ADP-Ribosylierung (PARylierung), spielen bei verschiedenen DNA-Reparaturmechanismen eine wichtige Rolle.In dieser Arbeit wurden die kovalente und die nichtkovalente Interaktion von Poly-ADP-Ribose (PAR) mit an der DNA-Reparatur beteiligten Proteinen charakterisiert.<br /><br />Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wechselwirkung des Tumorsuppressor-Proteins p53 mit PAR untersucht. Dieses spielt ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Zellantwort auf einen DNA-Schaden. In seiner aktiven Form liegt p53 als Tetramer vor. Es besitzt vier PAR-Bindedomänen, wovon eine in der Region liegt, die auch für die Tetramerisierung zuständig ist. Das legt die Vermutung nahe, dass die Interaktion mit PAR auch einen Einfluss auf das Tetramerisierungsgleichgewicht hat. Dieser Vermutung wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) nachgegangen. FCS ist seit etwa 30 Jahren eine beliebte Methode, um Wechselwirkungen im nanomolaren Bereich zu charakterisieren. Die Methode ist nicht invasiv und hoch sensitiv. Sie bietet sich deshalb für die Untersuchung von Protein-Protein- und Protein-Biomolekül-Interaktionen an. Nach dem Aufbau und der Charakterisierung des FCS-Experiments wurde in den ersten Messungen die Oligomerisierung der Tetramerisierungsdomäne von p53 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Dimerisierung und die Tetramerisierung einen sehr ähnlichen KD-Wert im nanomolaren Bereich haben. Das Tetramerisierungsgleichgewicht lässt sich wider Erwarten nicht von PAR beeinflussen. Allerdings haben kovalent an p53 gebundene Fluoreszenzfarbstoffe einen großen Einfluss auf die Tetramerisierung. Das wurde mit einer stabilisierten Mutante von p53 gezeigt. Dazu wurde p53 mit unterschiedlichen Farbstoffen und an verschiedenen Positionen markiert. Die markierten p53-Varianten liegen im kompletten beobachteten Konzentrationsbereich als Monomer vor, nehmen also nicht mehr an der Tetramerisierung teil. Die Beobachtungen zu der Oligomerisierung von p53 stehen zum Teil im Widerspruch mit von Rajagopalan et al. bereits publizierten Ergebnissen.<br /><br />Für die Interaktion von PAR mit anderen Proteinen spielt sowohl die Kettenlänge als auch der Verzweigungsgrad von PAR eine Rolle. Der Einfluss dieser beiden Parameter wurde anhand der Bindung von verschieden langer und verschieden stark verzweigter PAR an p53 und an das Linkerhiston H1 untersucht. Auch für die Charakterisierung dieser Biopolymer-Protein-Wechselwirkung wurde FCS verwendet. Zunächst wurde durch den Vergleich der gemessenen Diffusionszeiten mit theoretischen Werten der Diffusion von Ellipsoiden das Aspektverhältnis und damit die Form der verschiedenen PAR-Fraktionen genauer bestimmt. Das Aspektverhältnis der stark verzweigten Variante ist deutlich kleiner als das Aspektverhältnis der Wildtyp-Variante. Die stark verzweigte PAR-Variante hat demnach in etwa die Form eines Rugbyballs, während die Wildtyp-Variante deutlich stärker in die Länge gezogen ist. Dieser Unterschied wird mit zunehmender PAR-Kettenlänge größer. Zudem nimmt für längere PAR-Ketten die Bindungsstärke der PAR-p53- sowie der PAR-H1-Bindung zu. Für p53 fällt noch auf, dass PAR eine gewisse Mindestlänge haben muss, um gebunden zu werden. Beide Proteine binden die stark verzweigte Variante von PAR schwächer als die Wildtyp-Variante. Sowohl für die Bindung von PAR an p53 als auch an H1 konnten KD-Werte bestimmt werden. Zudem wurde die PAR-Bindedomäne 4 als stärkste PAR-Bindedomäne von p53 bestätigt. Für lange PAR-Wildtyp-Ketten und eine hohe Konzentration an p53 wurde durch das Aufnehmen von Photon Counting Histogrammen zudem gezeigt, dass sich eine größere Struktur bestehend aus mehreren PAR-Ketten und mehreren p53-Tetrameren ausbildet.<br /><br />Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der zeitlich und räumlich aufgelösten Beobachtung der PARylierung in lebenden Zellen. Dafür wurde FLIM-FRET-Mikroskopie verwendet. Um einen klar definierten Startpunkt zu haben und die PARylierung in einen räumlich definierten Bereich zu beobachten, wurde ein DNA-Schaden mit einem NIR-Laser geschrieben. Durch die räumliche Begrenzung des Schadens hat man in der Zelle Bereiche, die als Kontrolle dienen können. Zu Beginn dieses Projekts wurde ein Ti:Sa-Laser in ein bestehendes FLIM-Mikroskop integriert. Durch die Verwendung von EGFP-Fusionsproteinen und das Einbringen eines Fluoreszenzmarkierten NAD-Analogon in die Zellen, konnte die PARylierung von Proteinen über den FRET-Effekt beobachtet werden. In einer ersten Messreihe wurde der zeitliche Verlauf der PARylierung von ARTD1, XRCC1, PCNA und XPC für die ersten fünf Minuten aufgenommen. Diese Messreihe dient als proof of principle. Es wurde gezeigt, dass sowohl die Akkumulation der EGFP-markierten Proteine als auch die PARylierung in Echtzeit beobachtet werden können. In einem nächsten Schritt wurden die experimentellen Bedingungen und das Einbringen des NAD-Analogons in die Zellen optimiert. Es zeigt sich, dass die Kinetik der Akkumulation stark von der vorangegangenen Behandlung der Zelle abhängt. Um die literaturbekannte Kinetik zu erhalten, darf das NAD-Analogon nur mit sehr milden Verfahren in die Zellen eingebracht werden. Die Verwendung von DOTAP oder die Elektroporation der Zellen mit kurzen Pulsen (T ≤ 400 µs) haben sich als die zuverlässigsten Methoden erwiesen. Zusätzlich wurde ein Pulsepicker in den Laser-Aufbau integriert, damit der DNA-Schaden besser variiert werden kann. Um den DNA-Schaden komplett räumlich zu begrenzen, sind kleinere Wiederholraten und hohe Pulsenergien des Schadenslasers gut geeignet. Unter den verbesserten Bedingungen wurden erste Messungen der PARylierungskinetik von ARTD1, XRCC1 und macroH2A durchgeführt. Dabei zeigt sich für die verschiedenen Proteine ein klarer Unterschied im zeitlichen Verlauf. Fluoreszenzspektroskopische und -mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung von Poly(ADP-ribose) mit Proteinen 2020 terms-of-use Löffler, Tobias 2020-09-23T09:35:18Z

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