Studies on the regulation of genome maintenance factors by non-covalent interaction with poly(ADP-ribose) with a focus on RECQL helicases

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2016
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Sowohl RecQL Helikasen als auch Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung), d.h. Poly(ADP-Ribose) Polymerasen (PARPs) und ihr Produkt Poly(ADP-Ribose) (PAR), stellen wichtige Kontrollsysteme des DNA-Metabolismus dar und werden mit dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht (Veith and Mangerich, ARR, 2015). Zusätzlich zu ihrer namensgebenden Helikase-Aktivität besitzen RecQL Helikasen auch ATPase-Aktivität und Einzelstrang-annealing-Aktivität und, im Falle von WRN, auch Exonuklease-Aktivität. PARPs hingegen katalysieren die Synthese des Signalmoleküls PAR, welches nach DNA-Schäden in großen Mengen produziert wird und kovalent oder nicht-kovalent an Zielproteine binden kann. PARPs und RecQL Helikasen weisen erhebliche Überschneidungen in ihren zellulären Funktionen auf, wozu DNA-Reparatur, Telomer-Instandhaltung, DNA-Replikation und Transkription zählen, und wurden daher beide passenderweise „Wächter des Genoms“ getauft. Infolgedessen ist es wenig überraschend, dass während der letzten zwei Jahrzehnte vermehrt Belege für eine florierende Zusammenarbeit von RecQL Helikasen und PARPs/PARylierung aufkamen. Allerdings blieb dabei weitestgehend unklar, welche Rolle die nicht-kovalente Interaktion von PAR und RecQL Helikasen in diesem Zusammenhang spielt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, unser Verständnis von der Rolle der nicht-kovalenten PAR-Interaktion innerhalb der DNA-Schadensantwort zu verbessern, mit dem Schwerpunkt auf den beiden RecQL Helikasen WRN und RECQL5. Dazu wurde erstens eine neue, LC-MS/MS-basierte Methode etabliert um Exonuklease-Aktivität zu quantifizieren, mit WRN als beispielhafter Exonuklease (Mangerich/Veith et al., MAD, 2012). Anstatt, wie in den standardmäßig Gel-basierten Exonuklease-Versuchen, das Leitermuster des abgebauten DNA-Strangs zu analysieren werden hier die einzelnen Nukleoside gemessen, die bei dem Exonuklease-Verdau freigesetzt werden. Diese können mittels Flüssigchromatografie-gekoppelter Massenspektrometrie eindeutig identifiziert und quantifiziert werden. Die Benutzung dieser Methode erlaubt eine detailliertere Untersuchung der Regulierung von WRN’s Exonuklease-Aktivität und hat das Potential, die Suche nach Exonuklease-Inhibitoren für WRN zu vereinfachen. Zweitens konnte gezeigt werden, dass alle RecQL Helikasen nicht-kovalent mit PAR interagieren und dass diese Interaktion, zumindest im Fall von WRN und RECQL5, durch mehrere schwach konservierte PAR-Bindemotive (PBM) vermittelt wird (Popp/Veith et al., ACS Chem Biol, 2013; Khadka/Hsu, Veith, et al., Mol Cell Biol, 2015). Des Weiteren erbrachten Versuche, bei denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht wurden, den Nachweis, dass die konservierten basischen Aminosäuren des PBM essentiell für die PAR-Bindung sind. Das Zusammenspiel mit PARP1, PARyliertem PARP1 oder PAR reguliert die Funktionen von WRN und RECQL5 unterschiedlich. Während sämtliche enzymatischen Aktivitäten von WRN, d.h. Helikase-, Exonuklease-, ATPase- und annealing-Aktivität, bis zu einem gewissen Grad durch die nicht-kovalente Interaktion mit freier PAR oder PARyliertem PARP1 gehemmt werden, wird die annealing-Aktivität von RECQL5 dadurch verstärkt. Interaktion mit nicht-modifiziertem PARP1 hatte dagegen eine hemmenden Wirkung auf alle katalytischen Aktivitäten beider Proteine, mit Ausnahme der ATPase-Aktivität. Drittens konnte gezeigt werden, dass die gut beschriebene Translokation von WRN aus den Nukleoli zu DNA-Schäden vollständig von der Präsenz von PARP1, aber nur wenig von der PARP-Aktivität abhängig ist, zumindest im Fall oxidativer Schäden (Veith/Schink et al., in Vorbereitung). Viertens erlaubt es ein neu entwickeltes HeLa PARP1 Knock-Out Zellsystem, die Funktionen humaner PARP1 und seine Wechselwirkungen mit anderen Reparaturproteinen mit größerer Genauigkeit und in einem zellulären Kontext zu analysieren. In Verbindung mit diesem Projekt konnte die nicht-kovalente Interaktion von PARP1 und seinem Produkt PAR mit größerer Präzision charakterisiert werden (Rank/Veith et al., in Vorbereitung). Diese Interaktion, welche zwei neu identifizierten PBM zugeordnet werden konnte, führte zu der Bildung von höhermolekularen Komplexen und deutet damit auf eine PAR-abhängige Multimerisierung von PARP1 hin. Andererseits wurde die DNA-Bindung von PARP1 durch die nicht-kovalente Interaktion mit PAR unterbrochen. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die nicht-kovalente Interaktion von PARP1 mit PAR sowohl die Dynamik der Rekrutierung als auch des Verweilens von PARP1 an DNA-Schäden reguliert. Zu guter Letzt konnte CSB als neues PAR-Bindeprotein etabliert werden, eine Eigenschaft die erhebliche Konsequenzen für seine zellulären Funktionen hat (Scheibye-Knudsen, […], Veith, et al., Cell Metabolism, 2014). Die nicht-kovalente Interaktion ist einerseits notwendig für das Verweilen von CSB an DNA-Schäden, aber andererseits auch für das Entfernen von aktiviertem PARP1 vom DNA-Schaden durch CSB. Die anhaltende Aktivierung von PARP1 im Falle des Verlustes von CSB (wie z.B. beim Cockayne Syndrom) und die daraus resultierende Erschöpfung der NAD+-Speicher könnten zu den schädlichen Auswirkungen des Cockayne Syndroms beitragen. Zusammengenommen bietet die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die Rolle der nicht-kovalenten PAR-Interaktion in der Regulation der DNA-Reparatur. Die kombinierten Ergebnisse die in dieser Arbeit vorgestellt werden erlauben wohlfundierte Spekulationen über die Steuerung der DNA-Reparatur durch die wechselseitige Regulierung von PARP1 und anderen Reparaturfaktoren: PARP-Aktivität ist nötig für die effiziente Rekrutierung und vollständige Aktivierung von PARP1 an DNA-Schäden. Andere Reparaturfaktoren, wie zum Beispiel RecQL Helikasen oder CSB, werden durch die nicht-kovalente Interaktion mit PAR effizienter zu den DNA-Schäden rekrutiert und scheinen wichtig für das Entfernen von PARP1 vom Schaden und die Beendigung der PARylierungs-Reaktion zu sein.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
PARP, PAR, WRN, RECQ, Aging
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ISO 690VEITH, Sebastian, 2016. Studies on the regulation of genome maintenance factors by non-covalent interaction with poly(ADP-ribose) with a focus on RECQL helicases [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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February 12, 2016
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Konstanz, Univ., Doctoral dissertation, 2016
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