Development of molecular tools in the diatom Phaeodactylum tricornutum

Abstract

Kieselalgen (Diatomeen), einzellige, eukaryotische Algen besiedeln die Ozeane und Süßwasserhabitate. Sie gehören zusammen mit Cyanobakterien zu den am häufigsten auftretenden phytoplanktonischen Lebensformen auf der Erde und sind daher von großer ökologischer Bedeutung. Ein besonderes Merkmal der goldbraun gefärbten Algen ist ihre Eigenschaft ornamentierte Schalen (frustules) aus Kieselsäure zu bilden. In der Vergangenheit waren Kieselalgen wegen ihrer faszinierenden Physiologie als auch ihrer ökologischen Relevanz Gegenstand zahlreicher Studien. In letzter Zeit wurde ebenfalls ihr Potential für biotechnologische Anwendungen erkannt. Da intensivere Studien an Diatomeen in jüngster Zeit häufig durch den Mangel an Genomdaten sowie einer limitierten Auswahl an geeigneten molekularbiologischen Methoden und molekularen Werkzeugen beeinträchtigt worden waren, erhöhte sich die Nachfrage nach einem Modellorganismus für Kieselalgen sowie nach geeigneten molekularbiologischen Methoden.Diese Dissertation behandelt Phaeodactylum tricornutum, eine pennate Kieselalge, die einfach unter Laborbedingungen kultiviert und erforscht werden kann, weshalb sie bereits als möglicher Modellorganismus für Diatomeen diskutiert worden war. Daher wurde auch in diesen Tagen die Sequenzierung ihres Genoms erfolgreich abgeschlossen, die Annotierung des Genoms geht ebenfalls ihrer Vollendung entgegen. (http://shake.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html). Um Phaeodactylum tricornutum im weiteren zugänglich für postgenomische Anwendungen zu machen, sowie um die Rolle der Alge als Modellorganismus für Diatomeen weiter zu festigen, war es das Ziel dieser Dissertation, verschiedene, bislang nicht zur Verfügung stehenden, molekularbiologische Anwendungen zur Erforschung von Kieselalgen zu entwickeln.Kapitel II.1 beschreibt drei verschiedene Strategien zur Entwicklung eines stabilen Plastidentransformationssystems für Phaeodactylum tricornutum. Die Strategien basieren auf der Insertion des Streptomycinresistenzgens aadA entweder als zusätzliches Operon- Gen in das plastidär codierte RUBISCO-Operon, oder in nichtcodierende intergenische Bereiche des Chloroplastengenoms. Eine weitere Strategie basiert auf der Substitution des funktionellen psbA Gens durch Versionen die verschiedene Punktmutationen tragen und so zur Herbizidresistenz führen soll. Die Resultate der Transformationsexperimente legen nahe, dass Streptomycinresistenz transient in der Plastide der Kieselalge induziert werden kann, jedoch eine stabile Expression des Markers war nicht möglich. Unklar bleibt, ob Marker nur temporär in das plastidäre Genom integrieren oder transient von episomalen Plasmiden exprimiert werden.Kapitel II.2 beschreibt erstmalig einen induzierbaren und wahrscheinlich gerichteten mutagenen Mechanismus der Mutationen im Plastidengenom von Phaeodactylum tricornutum erzeugt. Mutagenese konnte in den plastidär codierten Genen für D1 (psbA) und für die 16S rRNA gezielt induziert werden. Das Phänomen einer induzierbaren Mutagenese wurde bereits intensiv in E. coli studiert und konnte darüber hinaus auch in Eukaryoten beobachtet werde. Die hier vorliegende Studie beschreibt jedoch erstmalig induzierbare Mutagenes in einem Organellengenom. Die Aufklärung des Auslösers für die gerichtete Mutagenese in einem Zielgen könnte neben ihren genetischen Implikationen auch zur gentechnischen Manipulation von Plastidengenomen beitragen. Die Konsequenzen der aktiven Induzierung von Mutagenese im Genom eines Zellorganells für dessen Evolutionsraten und damit einhergehend für unser Verständnis von Plastidenevolution sind beachtlich.Kapitel II.3 enthält ein Protokoll das Gen-Silencing in Phaeodactylum tricornutum erlaubt, eine Anwendung, die bislang nicht zur Erforschung von Kieselalgen zur Verfügung stand. Als Zielgen wurde das Gen für die Diadinoxanthin Deepoxidase (dde) gewählt, die essentiell für den Lichtschutzmechanismus NPQ ist. Zwei verschiedene Strategien erzeugten gleichermaßen Transformanden, die einen deutlich NPQ-reprimierten Phänotyp aufwiesen. Die Mehrheit der untersuchten Transformanden zeigte eine Reduktion des NPQ um 30-47% im Vergleich zum Wildtyp. Durch Untersuchungen des dde- Transkriptlevels mittels RT-qPCR konnten Unterschiede zwischen Transformanden und Wildtyp, als auch zwischen den aus unterschiedlichen Silencing-Strategien hervorgegangenen Transformanden nachgewiesen werden. Diese Unterschiede legten nicht nur die Anwendbarkeit von Gen-Silencing in Kieselalgen nahe, sondern darüber hinaus das Vorhandensein zweier verschiedener Silencing-Mechanismen in Phaeodactylum tricornutum.Im Gegensatz zu Sequenzanalysen, die sich auf den genetischen Inhalt konzentrieren, der in der Nukleotidabfolge der DNA codiert liegt, beschreibt Kapitel II.4 Techniken, die die Betrachtung und Erforschung der verschiedenen in Organellen und Zellkern liegenden Genome ermöglicht. Kapitel II.4 enthält ein Protokoll das ersmalig die selektive in vivo Visualisierung von beiden organellären Genomen im selben Organismus erlaubt. Im Weiteren wird eine Methode präsentiert, die mittels RT-qPCR die exakte Bestimmung der Ploidien in Chloroplast und Mitochondrialem Netzwerk ermöglicht.