Untersuchungen zu den Untereinheiten des Replikations-Proteins A (RPA)

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Datum
2002
Autor:innen
Eckerich, Carmen
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Investigation on RPA (Replication Protein A) subunits
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Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

RPA (Replication Protein A) ist das häufigste eukaryontische Bindeprotein für einzelsträngige DNA, und durch seine DNA-Bindung und Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen an allen wesentlichen Vorgängen des DNA-Metabolismus beteiligt. In der Zelle sowie in gereinigter Form ist RPA ein Trimer aus drei verschiedenen Untereinheiten. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, bekannte Fähigkeiten und Eigenschaften des RPA-Komplexes den einzelnen Untereinheiten zuzuordnen, die dafür verantwortlichen Domänen einzugrenzen, und zu untersuchen inwieweit das Zusammenspiel sämtlicher Untereinheiten für bestimmte Reaktionen notwendig ist. Im ersten Teil der Arbeit wurden vergleichende biochemische und elektronenmikroskopische Versuche mit trimerem RPA und einer Deletionsmutante der großen Untereinheit (RPA70delta) durchgeführt, die noch die primären ssDNA Bindedomänen von RPA besitzt. Diese Experimente zeigten, dass die primären ssDNA-Bindedomänen sowohl für die spezifische Bindung an einzelsträngige DNA als auch für die damit zusammenhängende Entwindung doppelsträngiger DNA ausreichend sind; die beiden kleineren Untereinheiten sind, zumindest in vitro, für diese Eigenschaften entbehrlich. Die Struktur der Nukleoprotein-Komplexe von trimerem RPA und RPA70delta unterscheiden sich aber signifikant, besonders in Anwesenheit geringer Konzentrationen von Zinkionen. Da Zink bei trimerem RPA zu einem Kollabieren der Komplexe führt, nicht aber bei der Deletionsmutante, der der carboxyterminale Zinkfinger fehlt, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine wichtige Funktion des Zinkfingers für die Struktur von RPA/DNA-Komplexen in der lebenden Zelle hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Stabilität des RPA-Trimers in vivo untersucht. Dazu mussten Methoden zur effizienten Trennung von löslichem und chromatingebundenem RPA entwickelt werden. Nachdem unsere früheren Arbeiten in der chromatingebundenen Fraktion bereits eine Phosphorylierung der mittleren Untereinheit und deren Dissoziation vom Trimer gezeigt hatten, lag der Schwerpunkt der hier durchgeführten Experimente auf der kleinen Untereinheit. Wir konnten zeigen, dass auch ein signifikanter Anteil der kleinen Untereinheit bei der Bindung an Chromatin vom Trimer dissoziiert. Ergänzende Versuche mit gereinigten Komponenten legen den überraschenden Schluß nahe, dass die Bindung von RPA an doppelsträngige - nicht aber an einzelsträngige - DNA zu einer Destabilisierung des Trimers führt. Weiterführende Arbeiten werden klären müssen, welche physiologische Rolle der Zerfall des chromatingebundenen RPA spielt.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

RPA (Replication Protein A) is the most abundant ssDNA-binding protein (single stranded DNA-binding protein) of the eukaryotic cell. Because of its ssDNA-binding activity on one hand and its interaction with many other cellular proteins on the other hand, it is involved in all important reactions of the DNA-metabolism. RPA in the cell and purified is a trimer of three different subunits. One aim of the present study was to assign the different known properties and capabilities of the RPA trimer to the individual subunits, to localize the responsible domains and to investigate whether the interplay of all subunits is needed to carry out a special reaction. In the first part of the work, comparative biochemical and electron microscopical studies between the RPA trimer and a deletion-mutant of the largest subunit (RPA70delta) were performed. RPA70delta still carries the primary ssDNA-binding domains. The results show that the primary DNA-binding domains are responsible and sufficient for the specific ssDNA-binding activity, as well as for the dsDNA(double stranded DNA)-unwinding activity of RPA. The two smaller subunits are - at least in vitro - dispensable for these RPA-functions. The structure of the nucleoprotein-complexes of RPA and RPAdelta differ significantly, especially in the presence of low concentrations of zinc ions. Because zinc causes a collapse of the nucleoprotein-complexes of RPA but not RPAdelta, which misses the carboxyterminal zinc finger domain, these results point to an important function of the zinc finger in the structure of the RPA/DNA-complex in living cells. In the second part of the work, the stability of the RPA trimer in vivo was investigated. To this end, efficient methods to seperate the soluble and chromatin bound proportion of RPA had to be developed. Because former work of our group had shown that the middle subunit of the chromatin bound proportion of RPA is phosphorylated and dissociates from the trimer, we mainly focus on the smallest subunit, RPA14. Here we were able to show that also a significant part of the small subunit dissociates from the trimer by binding on the chromatin. Complementary experiments with purified components implicate that, surprisingly, binding of RPA to double but not single stranded DNA induces a destabilisation of the RPA trimer. Further studies have to clearify the physiological role of dissociation of chromatin bound RPA.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
replication protein a, replication, DNA repair, electron microscopy, single strand DNA binding protein
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690ECKERICH, Carmen, 2002. Untersuchungen zu den Untereinheiten des Replikations-Proteins A (RPA) [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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March 7, 2002
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