Untersuchungen zu den Untereinheiten des Replikations-Proteins A (RPA)

Abstract

RPA (Replication Protein A) ist das häufigste eukaryontische Bindeprotein für einzelsträngige DNA, und durch seine DNA-Bindung und Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen an allen wesentlichen Vorgängen des DNA-Metabolismus beteiligt. In der Zelle sowie in gereinigter Form ist RPA ein Trimer aus drei verschiedenen Untereinheiten. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, bekannte Fähigkeiten und Eigenschaften des RPA-Komplexes den einzelnen Untereinheiten zuzuordnen, die dafür verantwortlichen Domänen einzugrenzen, und zu untersuchen inwieweit das Zusammenspiel sämtlicher Untereinheiten für bestimmte Reaktionen notwendig ist. Im ersten Teil der Arbeit wurden vergleichende biochemische und elektronenmikroskopische Versuche mit trimerem RPA und einer Deletionsmutante der großen Untereinheit (RPA70delta) durchgeführt, die noch die primären ssDNA Bindedomänen von RPA besitzt. Diese Experimente zeigten, dass die primären ssDNA-Bindedomänen sowohl für die spezifische Bindung an einzelsträngige DNA als auch für die damit zusammenhängende Entwindung doppelsträngiger DNA ausreichend sind; die beiden kleineren Untereinheiten sind, zumindest in vitro, für diese Eigenschaften entbehrlich. Die Struktur der Nukleoprotein-Komplexe von trimerem RPA und RPA70delta unterscheiden sich aber signifikant, besonders in Anwesenheit geringer Konzentrationen von Zinkionen. Da Zink bei trimerem RPA zu einem Kollabieren der Komplexe führt, nicht aber bei der Deletionsmutante, der der carboxyterminale Zinkfinger fehlt, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine wichtige Funktion des Zinkfingers für die Struktur von RPA/DNA-Komplexen in der lebenden Zelle hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Stabilität des RPA-Trimers in vivo untersucht. Dazu mussten Methoden zur effizienten Trennung von löslichem und chromatingebundenem RPA entwickelt werden. Nachdem unsere früheren Arbeiten in der chromatingebundenen Fraktion bereits eine Phosphorylierung der mittleren Untereinheit und deren Dissoziation vom Trimer gezeigt hatten, lag der Schwerpunkt der hier durchgeführten Experimente auf der kleinen Untereinheit. Wir konnten zeigen, dass auch ein signifikanter Anteil der kleinen Untereinheit bei der Bindung an Chromatin vom Trimer dissoziiert. Ergänzende Versuche mit gereinigten Komponenten legen den überraschenden Schluß nahe, dass die Bindung von RPA an doppelsträngige - nicht aber an einzelsträngige - DNA zu einer Destabilisierung des Trimers führt. Weiterführende Arbeiten werden klären müssen, welche physiologische Rolle der Zerfall des chromatingebundenen RPA spielt.