Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry
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Zusammenfassung
Autoimmunerkrankungen haben in den letzten Jahren zunehmende medizinische Bedeutung aufgrund der zunehmeden Zahl individueller Erkrankungen und der geringen Kenntnisse über Krankheitsursache(n) erlangt. Eindeutige Hinweise auf die Bedeutung des Immunsystems für Pathogenese und Verlauf von Autoimmunerkrankungen wurden erhalten, die derzeit zur Entwicklung von neuen therapeutischen Ansätzen führen; künftige Fortschritte in der Entwicklung und Herstellung von wirksamen Vaccinen werden jedoch wesentlich von dem besseren Verständnis der strukturellen Grundlagen des Immunsystems abhängen. Die Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit, Genauigkeit der Massenbestimmung, schnellen Analysenzeiten und Anwendbarkeit zur Analyse komplexer Gemische als Hochleistungsmethode für Strukturaufklärung von Proteinen und Charakterisierung von Protein-Interaktionen erwiesen.
Ein zentrales Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Bildung und Ablagerung von Aggregaten des ß-Amyloid (Aß) im Gehirn. Die beiden ersten Abschnitte der vorliegenden Dissertation behandeln die Aufklärung der vollständigen Primärstukturen sowie Identifizierung der N-Glykosilierung von Aß-spezifischen Antikörpern. Plaque-spezifische Antikörper erkennen ein N-terminales Aß-Epitop. Mittels HPLC-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) konnte die vollständige Struktur eines Plaque-spezifischen monoklonalen Maus-Antikörpers aufgeklärt werden. Nahezu vollständige Sequenzbestimungen wurden mittels Datenbank-Suchverfahren sowie De novo - Sequenzierung für die schweren und leichten Ketten erhalten, insbesondere die vollständige Aufklärung von 5 der 6 CDR-Sequenzen des Antikörpers. Die Glycosilierung im Fc-Teil des Antikörpers wurde als Komplexstruktur-Typ mit bis zu 4 terminalen Galactosylresten und einem geringen Anteil an N-Glycolyl-Neuraminsäure identifiziert.
Physiologische humane Aß-Antikörper ( Plaque-protektive Antikörper) wurden im Plasma von gesunden Personen identifiziert, die ein Epitop im C-terminalen Bereich (Aß-(21-37)) erkennen und die Bildung von Aß-Aggregaten inhibieren. Die vollständige Primärstruktur und Glykosilierung eines Plaque-protektiven monoklonalen Antikörpers der Maus gegen ein Aß(17-24) Epitop wurde mittels LC-MS/MS, in Kombination mit Stoss-induzierter Dissoziation (CID) und Elektronentransfer- Dissoziation (ETD) aufgeklärt. Die Strukturen aller 6 CDR-Domänen sowie eine bisher unbekannte Konsensus-Sequenz der Glycosilierung in den leichten Ketten konnten bestimmt werden. Die Glycosilierungsstruktur enthält teilweise hybridisierte Glycane der Mehrantennenstruktur mit einem High-mannose -Typ und einem Komplex-Typ, und terminalen N-Acetyl- und N-Glycolyl-Neuraminyl-Gruppen.
Weitere Strukturuntersuchungen wurden von humanen, Plaque-protektiven Aß-Autoantikörpern aus Immunglobulinpräparaten nach Affinitätsisolierung mit immobilisiertem Aß(12-40) durchgeführt. Durch Bestimmung der Primärstrukturen konnten alle 4 IgG-Subklassen auf der Ebene der entsprechenden Glycopeptide bestimmt werden. Die Subklassen-spezifische Glykosilierung ergab relativ erhöhte Anteile an IgG2/IgG3 sowie IgG4. Die Bestimmung der Glykanstruktur der einzelnen IgG-Subklassen ergab ähnliche Glycosilierungen mit leicht erhöhtem Agalactosylanteil.
ß-Amyloid wird durch proteolytische Prozessierung des Transmembran-Amyloid-Vorläuferproteins APP gebildet, dessen genaue Struktur und Funktionen bisher nicht bekannt ist. In Strukturuntersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten 3 spezifische O-Glycosilierungen an den Threoninresten T291, T292 und T576 mittels LC-MS/MS in Kombination mit ETD- und CID- Fragmentierung aufgeklärt werden. Die O-Glycosilierungen wurden als kurze Core-1 Typ- Glycane mit N-Acetylgalactosamin und terminalen Silinsäureresten, sowie linearen (T291, T292) und verzweigten Strukturen (T576) identifiziert.
Im letzten Abschnitt der Arbeit wurde die Subklassen-spezifische Glycosilierung von Plasma-Immunglobulin bei Patienten mit Myositose, im Rahmen einer klinisch-diagnostischen Studie zur Ermittlung von Risikofaktoren bei Patienten mit systemisch-rheumatischen Erkrankungen untersucht. Plasma IgG wurde von Patienten, gesunden Zwillingen sowie Kontrollgruppen gleichen Alters mittels Protein G-Affinitätschromatographie isoliert. Die Analyse der Glycosilierungsstruktur ergab statistisch signikante Erhöhungen von fucosylierten Agalactosyl-Glycoformen bei Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuten auf eine genetische Prädisposition für die Entwicklung von Autoimmun-Erkrankungen, möglicherweise aufgrund von Umweleinflüssen.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Autoimmune-related diseases have become a major medical concern in recent years due to the increasing number individuals affected and the poor understanding of disease etiology. Evidence suggests the implication of the immune system in the pathogenesis and progression of autoimmune diseases, and new therapeutic approaches targeting the immune system are being developed. Future advances in the design of effective vaccines will substantially depend on a more complete understanding of the structural basis of immune responses. Mass spectrometry has emerged as a high performance tool for protein structure determination and characterization of protein protein interactions, because of its sensitivity, high mass accuracy, short analysis time and applicability to mixtures.
An important histopathological hallmark of Alzheimer's disease is the deposition of ß-amyloid plaques in brain. The first two chapters of this thesis are focused on the determination of complete primary structures, and elucidation of the N-glycosylation structures of Aß-specific antibodies. Plaque-specific antibodies produced by active immunization with Aß recognize an epitope located at the Aß N-terminus. Using LC-MSMS, the complete structural characterization of a plaque-specific mouse monoclonal antibody was performed. Using both database search and de novo sequence analysis, near-complete sequence determinations were obtained for both heavy and light chains, and the amino acid sequences of five of the six complementary determining regions were completely elucidated. The major glycan structure attached at the heavy chain constant region was identified to be of complex type with zero to four terminal galactose residues and minimal amounts of N-glycolyl neuraminic acid.
Human physiological Aß-antibodies ("plaque-protective" antibodies) were identified in plasma of healthy individuals and recognize an epitope located in the C-terminal region of Aß (residues (21-37)). The complete primary structure and glycosylation of a plaque-protective mouse monoclonal antibody, raised against an epitope located at residues (17-24) of Aß, was obtained by LC-MS/MS, in combination with collision induced dissociation and electron-transfer dissociation (CID and ETD) fragmentation. The structures of all six CDRs, and an unexpected consensus amino acid sequence of N-linked glycosylation were elucidated in the light chain. This glycosylation site was identified to carry partially hybrid glycans having one antenna of high mannose type, and a second one of complex type, terminated with N-acetyl and N-glycolyl neuraminic acid.
Epitope-specific affinity purification of plaque-protective, human Aß-autoantibodies from commercial immunoglobulins was performed using immobilized Cys-Aß(12-40), and the determination of their primary structures indicated the presence of all four IgG subclasses. Subclass- specific glycosylation analysis, performed at the glycopeptide level, revealed elevated amounts of IgG2/IgG3 and IgG4, respectively. The glycan structure of each subclass indicated comparable amounts of the individual glycoforms in the Aß-autoantibody and pooled immunoglobulins, with a slight tendency towards increased agalactosylation of the autoantibody.
The ß-amyloid peptide is derived by proteolytic processing of the amyloid precursor protein APP, a transmembrane protein of hitherto largely unknown function. The elucidation of the O-glycosylation structures of APP at three specific sites, Thr291, Thr292 and Thr576, was obtained using LC-MS and a combination of ETD and CID fragmentation. The O-glycosylation sites, Thr291, Thr292 and Thr576, were found to comprise multiple short Core-1 type glycans. The minimal O-glycan structure was N-acetyl galactosamine (GalNAc), while elongated structures were identified to contain the GalNAc Gal core terminated with sialic acid, attached either in a linear fashion to galactose, or branched with attachment to GalNAc.
In the last chapter of this thesis, the determination of subclass specific glycosylation structures of total plasma IgG from myositis patients was performed as part of a clinical study aimed at delineating genetic and environmental risk factors for pathogenesis of systemic rheumatic disorders. Total plasma IgG from patients, healthy twins/siblings and unrelated age matched controls was isolated using protein G affinity chromatography. Analysis of glycopeptides from each subclass revealed elevated amounts of core-fucosylated agalaytosyl glycoform (G0F) in patients compared to unrelated controls, and these two groups were found to be statistically different. In contrast, statistical analysis of patients siblings and siblings controls groups suggested a random structure distribution of antibody glycosylation. This indicated the existence of a genetic predisposition of healthy siblings towards development of an autoimmune condition, possibly as a result of various environmental exposures.
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ISO 690
PERDIVARA, Irina, 2009. Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Die beiden ersten Abschnitte der vorliegenden Dissertation behandeln die Aufklärung der vollständigen Primärstukturen sowie Identifizierung der N-Glykosilierung von Aß-spezifischen Antikörpern. Plaque-spezifische Antikörper erkennen ein N-terminales Aß-Epitop. Mittels HPLC-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) konnte die vollständige Struktur eines Plaque-spezifischen monoklonalen Maus-Antikörpers aufgeklärt werden. Nahezu vollständige Sequenzbestimungen wurden mittels Datenbank-Suchverfahren sowie De novo - Sequenzierung für die schweren und leichten Ketten erhalten, insbesondere die vollständige Aufklärung von 5 der 6 CDR-Sequenzen des Antikörpers. Die Glycosilierung im Fc-Teil des Antikörpers wurde als Komplexstruktur-Typ mit bis zu 4 terminalen Galactosylresten und einem geringen Anteil an N-Glycolyl-Neuraminsäure identifiziert.<br />Physiologische humane Aß-Antikörper ( Plaque-protektive Antikörper) wurden im Plasma von gesunden Personen identifiziert, die ein Epitop im C-terminalen Bereich (Aß-(21-37)) erkennen und die Bildung von Aß-Aggregaten inhibieren. Die vollständige Primärstruktur und Glykosilierung eines Plaque-protektiven monoklonalen Antikörpers der Maus gegen ein Aß(17-24) Epitop wurde mittels LC-MS/MS, in Kombination mit Stoss-induzierter Dissoziation (CID) und Elektronentransfer- Dissoziation (ETD) aufgeklärt. Die Strukturen aller 6 CDR-Domänen sowie eine bisher unbekannte Konsensus-Sequenz der Glycosilierung in den leichten Ketten konnten bestimmt werden. Die Glycosilierungsstruktur enthält teilweise hybridisierte Glycane der Mehrantennenstruktur mit einem High-mannose -Typ und einem Komplex-Typ, und terminalen N-Acetyl- und N-Glycolyl-Neuraminyl-Gruppen.<br />Weitere Strukturuntersuchungen wurden von humanen, Plaque-protektiven Aß-Autoantikörpern aus Immunglobulinpräparaten nach Affinitätsisolierung mit immobilisiertem Aß(12-40) durchgeführt. Durch Bestimmung der Primärstrukturen konnten alle 4 IgG-Subklassen auf der Ebene der entsprechenden Glycopeptide bestimmt werden. Die Subklassen-spezifische Glykosilierung ergab relativ erhöhte Anteile an IgG2/IgG3 sowie IgG4. Die Bestimmung der Glykanstruktur der einzelnen IgG-Subklassen ergab ähnliche Glycosilierungen mit leicht erhöhtem Agalactosylanteil.<br />ß-Amyloid wird durch proteolytische Prozessierung des Transmembran-Amyloid-Vorläuferproteins APP gebildet, dessen genaue Struktur und Funktionen bisher nicht bekannt ist. In Strukturuntersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten 3 spezifische O-Glycosilierungen an den Threoninresten T291, T292 und T576 mittels LC-MS/MS in Kombination mit ETD- und CID- Fragmentierung aufgeklärt werden. Die O-Glycosilierungen wurden als kurze Core-1 Typ- Glycane mit N-Acetylgalactosamin und terminalen Silinsäureresten, sowie linearen (T291, T292) und verzweigten Strukturen (T576) identifiziert.<br />Im letzten Abschnitt der Arbeit wurde die Subklassen-spezifische Glycosilierung von Plasma-Immunglobulin bei Patienten mit Myositose, im Rahmen einer klinisch-diagnostischen Studie zur Ermittlung von Risikofaktoren bei Patienten mit systemisch-rheumatischen Erkrankungen untersucht. Plasma IgG wurde von Patienten, gesunden Zwillingen sowie Kontrollgruppen gleichen Alters mittels Protein G-Affinitätschromatographie isoliert. 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