NUB1L and FAT10, two ubiquitin-like proteins involved in protein degradation

Abstract

FAT10 ist ein Mitglied der Proteinfamilie der ubiquitinähnlichen Proteine. Es kann, wie Ubiquitin, mit seinem carboxy-terminalen Diglycinmotiv kovalent an die Lysinseitenketten anderer, noch unbekanneter Proteine gebunden werden. Durch die Zytokine Tumor necrosis factor-a und Interferon-g ist es synergistisch induzierbar. Das Gen für FAT10 liegt im Haupthistokompatibilitätskomplex. In dieser Doktorarbeit zeige ich, dass sowohl freies, als auch an Zielproteine gebundenes FAT10 schnell durch das Proteasom abgebaut wird. Die Halbwertszeit von FAT10 beträgt circa eine Stunde. Wenn man FAT10 an den Amino-Terminus von sehr langlebigen Proteinen anhängt, wird deren Halbwertszeit in einem Maße verringert, der mit dem Effekt einer Fusion von Ubiquitin mit diesen Proteinen zu vergleichen ist. Die Entdeckung eines mit FAT10 interagierenden Proteins könnte eine mögliche Erklärung für diesen Effekt liefern, indem es eine Verbindung zwischen FAT10 und dem Proteasom herstellt. Bei einem Yeast two hybrid screen konnte NEDD 8 ultimate buster 1 long (NUB1L) als nicht-kovalenter Interaktionspartner von FAT10 identifiziert werden. Diese Interaktion wurde durch Koimmunopräzipitationen und eine in vitro Interaktion mit Glutathion-S-transferase-gekoppeltem FAT10 bestätigt. NUB1L ist genauso wie FAT10 durch Interferone induzierbar, und es wurde berichtet, dass NUB1L mit dem ubiquitinähnlichen Protein NEDD8 wechselwirkt, und dessen Abbau beschleunigt. In meiner Arbeit zeige ich, dass die Bindung von NUB1L an FAT10 deutlich stärker ist, als die an NEDD8, und dass NEDD8 die Bindung von FAT10 an NUB1L nicht behindert. Da SUMO oder Ubiquitin nach Kopplung an andere Proteine nicht mit NUB1L interagieren, kann man davon ausgehen, dass die Bindung von FAT10 oder FAT10 gekoppelten Proteinen an NUB1L spezifisch ist. FAT10 wird achtmal schneller in Gegenwart von NUB1L abgebaut, als in dessen Abwesenheit. Da in vitro gezeigt wurde, dass NUB1 an die Rpn10 Untereinheit des Proteasoms bindet, und in 26S Proteasomenpräperationen enthalten ist, könnte es sein, dass NUB1L FAT10 und FAT10-konjugierte Proteine zum Abbau in die Nachbarschaft des 26S Proteasoms transportiert. Der über FAT10 vermittelte Proteinabbau scheint ubiquitinunabhängig zu sein, da weder die Deletion aller Lysinreste von FAT10, noch die Expression von FAT10 in Zellen mit defekter Ubiquitinierungsmaschinerie den Abbau verzögert. Im Gegensatz zur Ubiquitinierung scheint die Modifikation mit FAT10 ein irreversibler Prozess zu sein. Eine Fusion von FAT10 mit GFP wurde nicht gespalten, sondern es wurden beide Proteine abgebaut. Dies deutet darauf hin, dass keine FAT10-dekonjugierenden Enzyme existieren. In dieser Arbeit zeige ich, dass sich der FAT10-vermittelte Proteinabbau in mehreren Punkten vom ubiquitinvermittelten unterscheidet. Zusammengefasst kann man sagen, dass die Modifikation mit FAT10 ein alternativer, ubiquitinunabhängiger Mechanismus ist, der zum Abbau von Proteinen durch das Proteasom führt. Dieser Weg ist Zytokin-induzierbar und nicht umkehrbar.