Structural insights into DNA polymerases encountering aberrant substrates

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dc.contributor.authorBergen, Konrad
dc.date.accessioned2015-02-19T07:15:23Z
dc.date.available2015-02-19T07:15:23Z
dc.date.issued2014eng
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dc.identifier.urihttp://kops.uni-konstanz.de/handle/123456789/29874
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kops.description.abstractDer Reproduktionszyklus allen Lebens beruht auf der zuverlässigen und genauen Verdopplung des genetischen Materials; dies wird von Enzymen bewerkstelligt, die als DNA abhängige DNA Polymerasen bezeichnet werden. Diese Enzyme katalysieren den Einbau von 2'-deoxy-ribonukleosid Triphosphaten (dNTP) komplementär zum parentalen Einzelstrang der Desoxyribonukleinsäure (DNS), indem das 5' Phosphat des einzubauenden dNTPs unter Abspaltung von Pyrophosphat kovalent mit der 3' Hydroxygruppe des wachsenden Primerstrangs verbunden wird. In vivo ist dieser Prozess nahezu fehlerfrei (eine Fehleinbaute auf 109-1010 Basenpaare). Auch in vitro können sehr geringe Fehlerraten (im Bereich von 10-6 -10-7) beobachtet werden, abhängig vom jeweiligen Enzym.<br />Diese Eigenschaften erlauben den Einsatz in biotechnischen Prozessen, die auf exakten Kopien der Ursprungsmaterials beruhen. Zusätzlich sind einige dieser Enzyme in der Lage modifizierte und unnatürliche dNTPs zu prozessieren.<br />Die hier vorgestellten Teile der Arbeit wurden im Laufe der Dissertation in drei Publikationen veröffentlicht. Die Arbeit "KlenTaq caught incorporating C5 and 7-deaza modified nucleotides" konzentriert sich auf strukturelle Daten, die aus der Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse ternärer Komplexe des Klenow-/Stoffel-Fragments der DNA Polymerase I aus Thermus aquaticus (KlenTaq) mit modifizierten dNTPS gewonnen wurden. Die verwendeten dNTP Analoga (von A. Baccaro und A. Steck zur Barcodierung von Oligonukleotiden entwickelt) zeigten eine herausragende Akzeptanz durch die Polymerase, daher wurden kristallographische Studien durchgeführt, um die strukturelle Basis aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass Typ und Länge des Linkers an der Nukleobase durch Wechselwirkungen zwischen Modifikation und Enzym einen entscheidenden Einfluss auf die Akzeptanz durch die Polymerase haben. In einem weiteren Manuskript ("Structures of KOD and 9° North Polymerases Complexed with Primer Template Duplex") werden binäre Strukturen der B-Familien Polymerasen KOD und 9°N im replikativen Modus beschrieben; sowie deren Interaktion zwischen Nukleinsäure und den Enzymen. Dies erlaubte Rückschlüsse auf die ausgeprägte Fähigkeit dieser Proteine hochmodifizierte DNS zu synthetisieren.<br />Den letzten Teil der Arbeit stellt eine kristallographische Studie einer KlenTaq Mehrfachmutante. Die von N. Blatter gefundene Mutante weist eine starke reverse Transkriptions-Aktivität auf. Über einen strukturellen Vergleich der Polymerase im Komplex mit doppelsträngiger DNA sowie einem DNA-RNA-Hybriden konnte der Einfluss der Mutationen auf die notwendigen strukturellen Anpassungen im Manuskript "Structure and Function of a thermostable DNA polymerase reading RNA" aufgezeigt werden.<br />Zusammenfassend ermöglichen strukturelle Einblicke in die Prozessierung natürlicher und anomaler Substrate durch DNA Polymerasen eine rationale Herangehensweise in der Wahl des Enzyms (und seiner Mutanten) sowie dem Design der Modifikation des Substrates, um wertvolle Werkzeuge für die Molekularbiologie und die klinische Dignostik zu entwickeln.deu
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