Role of the ubiquitin-like modifier FAT10 in protein degradation and immunity

Abstract

FAT10 ist ein Ubiquitin-ähnliches Protein, welches im Haupt-Gewebe-Kompatibilitäts (MHC) Lokus der Klasse I kodiert liegt. Mit den proinflammatorischen Zytokinen TNF-alpha und IFN-gamma ist es in Zellen fast jeder Herkunft induzierbar. FAT10 besteht aus zwei durch einen kurzen Linker verbundenen Ubiquitin-ähnlichen Domänen und besitzt an seinem C-terminus ein Di-Glycin Motiv, über welches es an seine Zielproteine kovalent konjugiert werden kann. Überexpression des wild-typ Proteins - aber nicht einer Mutante ohne Di-GlycinMotiv - führt zur Induktion von Caspase-abhängiger Apoptose in murinen und humanen Zelllinien. Sowohl FAT10 als auch seine Konjugate werden vom Proteasom mit der gleichen Geschwindigkeit abgebaut; und die N-terminale Fusion von FAT10 an langlebige Proteine wie GFP oder DHFR reduziert deren Halbwertszeit ebenso potent wie eine Fusion mit Ubiquitin. Der proteasomale Abbau von FAT10 - welcher unabhängig von Ubiquitin erfolgt - kann zusätzlich beschleunigt werden durch nicht-kovalente Interaktion von FAT10 mit dem UBL-UBA Protein NEDD8 Ultimate Buster 1-Long (NUB1L).Die vorliegende Arbeit untersucht die molekularen Faktoren dieser Beschleunigung und deckt eine doppelte Rolle für NUB1L sowohl als proteasomaler Rezeptor für FAT10 als auch als sogenannter "Facilitator" seines Abbaus auf. Obwohl FAT10 in der Lage ist, direkt mit dem 26S Proteasom zu interagieren, kann NUB1L als löslicher FAT10-Rezeptor fungieren indem es über seine UBL Domäne an das Proteasom und über seine drei UBA Domänen an FAT10 bindet. Interessanterweise ist die Interaktion zwischen NUB1L und FAT10 - zumindest in vivo - abhängig vom Vorhandensein aller drei UBA Domänen. Im Gegensatz dazu beruht Beschleunigung des FAT10-Abbaus alleine auf der Fähigkeit von NUB11L, über seine UBL Domäne an das 26S Proteasom zu binden. Des weiteren kann der Abbau der N-terminalen UBL Domäne von FAT10 - welche mit dem 26S Proteasom, aber nicht mit NUB1L interagieren kann - immer noch durch die Co-Expression von NUB1L beschleunigt werden.Mit Hilfe von Experimenten in einem in vitro System, welches aus aufgereinigtem 26S Proteasom sowie rekombinant exprimierten Substraten bestand, zeigt diese Arbeit, dass das 26S Proteasom durchaus in der Lage ist das Modell-Substrat FAT10-DHFR in vitro abzubauen - allerdings nur in der Gegenwart von NUB1L. Versuche in NUB1L knock-down Zellen lassen den Schluss zu, dass diese absolute Abhängigkeit des FAT10-gesteuerten Abbaus von NUB1L auch auf die Situation in vivo zutrifft. Dies ist ein Hinweis darauf, dass - zumindest im Falle des hier untersuchten Modell-Substrats - die Bindung von FAT10 an das Proteasom alleine nicht ausreicht, um einen effizienten Abbau seiner Zielproteine zu ermöglichen.Neben NUB1L wurde Histon Deacetylase 6 (HDAC6) als weiterer, nicht-kovalenter Interaktionspartner von FAT10 identifiziert. Zusätzlich zu seinen beiden katalytischen Domänen besitzt es eine Dynein-Bindedomäne sowie einen Ubiquitin-bindenden Zink-Finger (BUZ Domäne). Mit Hilfe dieser beiden Domänen fungiert es als Verbindung zwischen dem Dynein-Motor sowie polyubiquitylierten Proteinen und ermöglicht auf diese Weise deren Transport entlang von Mikrotubuli zum Aggresom. Diese Arbeit zeigt, dass HDAC6 nicht nur für den Transport von polyubiquitylierten Proteinen, sondern auch für den Transport von FAT10 und seinen Konjugaten zuständig ist. Unter Bedingungen in denen das Proteasom nur eingeschränkt funktioniert bindet HDAC6 an FAT10 und vermittelt seinen Transport zum Aggresom. Die Interaktion mit FAT10 wird durch zwei verschiedene Domänen von HDAC6 vermittelt, nämlich die BUZ Domäne und die erste katalytische Domäne, obwohl die Interaktion der beiden Proteine nicht von der katalytischen Aktivität von HDAC6 abhängig ist. Des weiteren zeigt diese Arbeit, dass sowohl die Anzahl als auch die Größe von FAT10 und Polyubiquitinhaltigen Aggresomen in HDAC6-defizienten Zellen stark reduziert sind.Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass FAT10 den schnellen und induzierbaren Abbau seiner Zielprotein durch nicht-kovalente Interaktion mit zwei verschiedenen Adapterproteinen vermittelt. Mit Hilfe des UBL-UBA Proteins NUB1L ist FAT10 in der Lage, seine Zielproteine dem Abbau durch das 26S Proteasom zuzuführen. Ist das Proteasom jedoch beeinträchtigt, vermittelt FAT10 stattdessen über seine Bindung an HDAC6 die Isolierung seiner Zielproteine im Aggresom.