Confocal microscopy on fluorescently labelled single DNA molecules and force-extension measurements on DNA carpets

Abstract

Ziel dieser Arbeit ist es chemische, molekularbiologische und physikalische Methoden zu entwickeln die es erlauben ein Ensemble von DNA Molekülen in definierter Weise zu strecken. Dies soll strukturanalytische Untersuchungen des B-S Übergangs von DNA erlauben, was zur Aufklärung der Wechselwirkung von DNA mit dem RecA protein beitragen könnte. RecA ist ein Protein, das für die Rekombination in E.coli verantwortlich ist. Um Kraft-Dehnungskurven an einem Ensemble von DNA Molekülen zu messen wurde eine neuartige Kraftapparatur entwickelt und charakterisiert. In dieser Apparatur werden die DNA Moleküle chemisch zwischen zwei Substraten gebunden. Dies wird durch funktionalisieren der DNA Enden mit spezifischen Ankermolekülen, wie z.B. Biotin, Digoxigenin oder Thiol, erreicht. \newline Als erstes wurde die Effizients der Funktionalisierung von DNA mit den Ankermolekülen bestimmt. Es wurde gezeigt, dass mindestens 70% der DNA Moleküle mit Biotin oder Digoxigenin markiert sind. Für mit Biotin markierte DNA Moleküle konnte eine maximale DNA Moleküldichte von 0.14 1/mikron^2 auf Streptavidin funktionalisierten Oberflächen nachgewiesen werden. Für mit Thiol markierte DNA Moleküle konnte die gleiche maximale Moleküldichte auf Goldoberflächen gefunden werden. Die beobachtete Bindungskinetik von mit Biotin markierten DNA Molekülen legt ein durch Diffusion kontrolliertes Bindungsmodell nahe. Weiterführende Experimente werden vorgeschlagen. Da einzelne DNA Moleküle mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz Mikroskopie aufgelöst werden können, ist es möglich Einzelmolekülexperimente durchzuführen. Dazu wurde lambda-DNA mit YOYO-1 fluoreszent gefärbt. Die Konturlänge der gefärbten DNA wurde bestimmt, indem DNA Moleküle in einem elektrischen Feld gestreckt wurden. Der gemessene Wert von 19.8 mikrometer stimmt mit Literaturwerten sehr gut überein. Außerdem wurden statische und dynamische Eigenschaften der gestreckten DNA Moleküle gemessen. Diese Messungen könnten zum Verständnis des Einflusses hydrodynamischer Wechselwirkungen auf die Polymerkonfiguration eines elektrokinetisch gestreckten Polymers beitragen. Unter Ausnützung der longitudinalen Auflösung der konfokalen Mikroskopie wurden zum ersten Mal 3-dimensionale Monomerdichte-Profile von DNA Molekülen verschiedener Länge gemessen. Es wurde eine exzellente Übereinstimmung mit theoretischen Voraussagen gefunden. Des Weiteren wurden die Endsegmente der DNA Moleküle mit fluoreszent gefärbten Kolloiden markiert. Dies ermöglichte es, die Verteilungsfunktion der Endsegmente zu messen. Diese Resultate sind die ersten experimentellen Tests theoretischer Vorhersagen für die Konformation von end-angehefteten Polymeren im "Mushroom" Regime.