Rolle der NOD-Rezeptoren für die intrazelluläre Immunerkennung von Chlamydophila pneumoniae und Charakterisierung der chlamydialen NOD-Liganden

Abstract

Chlamydophila pneumoniae ist ein weit verbreitetes Gram-negatives, respiratorisches Pathogen. Es vermehrt sich obligat intrazellulär in einem für ihn charakteristischen, biphasischen Entwicklungszyklus. Infektionen mit C. pneumoniae verlaufen überwiegend asymptomatisch, können aber auch schwere Atemwegserkrankungen verursachen. C. pneumoniae kann nach einer Erstinfektion längere Zeit im Wirtsgewebe persistieren. An der Immunerkennung von extrazellulären C. pneumoniae sind TLR Rezeptoren beteiligt. Neuere Studien konnten eine mögliche Rolle für die zytoplasmatischen NOD-Proteine bei der Erkennung der intrazellulären replikativen Form der Chlamydien aufzeigen. Die Liganden der NOD-Rezeptoren sind Muropeptide, Bausteine des PGN. Dieses konnte bisher nicht in C. pneumoniae nachgewiesen werden. Jedoch ist aus Genomanalysen bekannt, dass alle Schlüsselgene zum Auf- und Abbau von Peptidoglykan (PGN) vorhanden sind. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Rezeptoren NOD1 und NOD2 an der Erkennung von C. pneumoniae beteiligt und ob Muropeptide in C. pneumoniae nachweisbar sind.Um die erste Frage zu klären, wurden Zelllinien generiert, die stabil NOD1 oder NOD2 überexprimieren und nach Stimulation mit NOD-Liganden mit einer IL-8 Freisetzung reagieren. Die Expression der NOD-Proteine wurde im Westernblot überprüft, die Funktionalität durch Stimulation mit kommerziellen Muropeptiden getestet. Unter Verwendung dieser Zelllinien konnte eine Beteiligung beider NOD Rezeptoren an der Erkennung von C. pneumoniae bestätigt werden. Dabei konnte durch die Infektion der stabilen Zelllinien mit lebenden, UV- und hizteinaktivierten Chlamydien gezeigt werden, dass für die Erkennung durch NOD die Bakterien intrazellulär vorhanden sein müssen. Während der intrazellulären Vermehrungsphase war die stärkste Aktivierung der Zellen zu verzeichnen. Im nächsten Schritt wurde überprüft, ob die Erkennung der Chlamydien durch NOD einen Einfluss auf deren intrazelluläre Vermehrung hat. Hierfür wurde die Vermehrung der Chlamydien mittels Real-Time-PCR verfolgt. Es zeigte sich jedoch auch bei Langzeitkultivierung kein Einfluss von NOD auf die Replikation der Bakterien.Da alle Schlüsselgene zum Auf- und Abbau von PGN, dem typischen NOD-Liganden, im Chlamydiengenom vorhanden sind, wurde eine Transkriptionsanalyse der PGN-synthetisierenden Gene in C. pneumoniae durchgeführt. Diese zeigte, dass alle Gene mit ähnlicher Induktionskinetik und ähnlichem Transkriptionslevel in der intrazellulären Replikationsphase verstärkt abgelesen werden. Im nächsten Schritt wurde der direkte Nachweis von Muraminsäure, der PGN-Schlüsselkomponente, durch eine LC-MS Analyse versucht. Diese war für E. coli Bakterien erfolgreich, führte jedoch wahrscheinlich wegen mangelnder Sensitivität der Methodik zu keinem Ergebnis bei Chlamydien. Unter Verwendung des radioaktiven In-vitro-Phosphorylierungsassay, der auf der spezifischen Phosphorylierung von acetylierter Muraminsäure durch die Kinase MurK in der Gegenwart von radioaktivem ATP basiert, war es jedoch möglich, acetylierte Muraminsäure in intra- und extrazellulären C. pneumoniae nachzuweisen.Es konnte somit eine Rolle von NOD für die Immunerkennung von intrazellulären Chlamydien nachgewiesen werden. Sowohl die Daten der Transkriptionsanalyse als auch des In-vitro-Phosphorylierungsassays deuten auf das Vorhandensein von MurNAc vor allem im RB Stadium hin. Dies ist auch im Einklang mit den Daten zur IL-8 Freisetzung in den NOD-überexprimierenden Zellen, die am stärksten während der intrazellulären Vermehrung der Chlamydien ist, also dann, wenn die Chlamydien im RB Stadium vorliegen. Die PGN Bausteine werden wahrscheinlich über ein Typ III-Sekretionssystem, das in der Vermehrungsphase der Chlamydien exprimiert wird, ins Zytosol der Wirtszelle sekretiert, was der Zelle die Erkennung der Bakterien über NOD ermöglicht. Dies resultiert in einer Aktivierung der Zellen, einer wesentlichen Voraussetzung für die Rekrutierung weiterer Immunzellen und der Bekämpfung der Infektion.