Publikation: Struktur und Funktion humaner Acyl-CoA-Dehydrogenasen. Untersuchungen zum 'Sudden Infant Death Syndrom'
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The aim of this work was to establish an isolation method for recombinantly expressed human Acyl-CoA dehydrogenases form E. coli. The main interest was supposed to be the mutant K304E of medium-chain specific Acyl-CoA dehydrogenase. This enzyme may play an important role in the Sudden Infant Death.
An amino acid exchange at position 304 of the native enzyme, leads to a charge reversal an probably to an instability at this very position. Previous attempts to isolate this enzyme failed due to minute amounts or aggregation and degradation phenomena. A new method to detect and quantify recombinant Acyl-CoA dehydrogenase by the use of monospecific antiobodies was set up to unambiguosly measure inactive enzyme in crude extracts.
A chromatographic separation scheme based on maximum three different steps was developed to purify different forms of human Acyl-CoA Dehydrogenase. The mutant K304E of medim-chain specific acyl-CoA dehydrogenase could for the first time be separated in a highly pure form. Also, a transient binding of molecular chaperone GroEL could be shown for the mutant enzyme.
The biological activity of mutant K304E was against all expectations comparable to the native enzyme although the substrate specificity differed markedly towards long-chain fatty acid substrates. This could also be demonstrated by different extents of bleaching upon binding to substrates of various chain-lengths. The natural electron acceptor ETF also showed different binding behaviour to the mutant enzyme. All together, this lead to the assumption of slightly different shaped conformation of the mutant enzyme.
In analogy of the medium-chain specific enzyme, the recombinant long-chain specific enzyme could also be isolated using the same separation scheme. Long-chain specific Acyl-CoA dehydrogenase could crystalized and ist structure could be resolved.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Isolationsmethode rekombinant hergestellter humaner Acyl-CoA Dehydrogenasen aus E. coli. Das Hauptinteresse galt der mittelkettenspezifischen Mutante K304E-MCADh, die in Zusammenhang mit dem Plötzlichen Kindstod steht.
Durch einen Aminosäureaustausch an Position 304 kommt es zu einem Ladungswechsel, der zu einer Instabilität des Enzyms führt. Frühere Versuche zur Isolation scheiterten aufgrund ungenügender Mengen oder anderer Aggregations- und Degradationsphänomene. Durch Etablierung eines Verfahrens, das auf der Detektion und Quantifizierung durch monospezifische Antikörper beruhte, konnte unabhängig von der enzymatischen Aktivität der Nachweis, sowie die Quantifizierung rekombinanter MCADh im Zellextrakt erbracht werden.
Eine Methode, die mit drei chromatographischen Schritten auskam, konnte für die Isolation verschiedener Acyl-CoA Dehydrogenasen erarbeitet werden. K304E-MCADh konnte so erstmals als reines Enzym dargestellt und biochemisch charakterisiert werden. Eine transiente Bindung an molekulare Chaperone wurde dabei nachgewiesen.
Die Aktivität der mutanten K304E-MCADh war entgegen den Erwartungen mit der des nativen Enzyms vergleichbar, zeigte jedoch unterschiedliche Präferenzen zur Oxidation längerer Substrate. Ein modifiziertes Bindungsverhalten an Substrate unterschiedlicher Kettenlänge konnte durch Bleichungsexperimente bestätigt werden. Der natürliche Elektronenakzeptor ETF zeigte jedoch stark modifizierte Bindungscharakteristiken gegenüber dem nativen Protein. Dies läßt insgesamt auf eine Strukturvariation der mutanten Form K304E-MCADh schließen.
In Analogie zur mittelkettenspezifischen Acyl-CoA Dehydrogenase konnte erstmals eine rekombinante Form der langkettenspezifischen Acyl-CoA Dehydrogenase isoliert und biochemisch charakterisiert werden. Infolge dieser Reinigung konnte die Röntgenstruktur der langkettenspezifischen Acyl-CoA Dehydrogenase aufgeklärt werden.
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ISO 690
KRÄUTLE, Franz-Georg, 2001. Struktur und Funktion humaner Acyl-CoA-Dehydrogenasen. Untersuchungen zum 'Sudden Infant Death Syndrom' [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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