Physiology and biochemical diversity of bacterial cholate degradation

Abstract

Steroide sind weit verbreitete Naturstoffe, welche vor allem in eukaryotischen Organismen vorkommen und dort sehr verschiedene Funktionen erfüllen. In die Umwelt gelangen diese Verbindungen v.a. durch Abbau von pflanzlichem und tierischem Material und durch Exkretion. Bakterien können Steroide nur selten selbst bilden, jedoch sind viele Bakterien in der Lage, diese Verbindungen abzubauen oder zu transformieren. Über die Abundanz von Bakterien, welche Steroide in natürlichen Habitaten abbauen können, und über die Diversität der biochemischen Abbauwege ist bisher wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde der bakterielle Steroidabbau anhand des Gallensalzes Cholat als Modellsubstanz untersucht. Cholat ist ein oberflächenaktives Steroid, welches eine C5 Acylseitenkette am Kohlenstoffatom C17 des Steroidgerüstes aufweist. Pseudomonas sp. Stamm Chol1 kann mit Cholat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen und dieses unter aeroben Bedingungen komplett zu CO2 abbauen. Hierbei geschieht der aerobe Abbau über den sogenannten 9,10-Seco Weg, welcher bisher der einzige gut untersuchte Abbauweg für Steroide unter aeroben Bedingungen ist. Die Seitenkette von Cholat wird vermutlich über β Oxidation abgebaut, wobei ein Acetyl- (C2) und ein Propionyl-CoA (C3) Rest abgespalten werden.Im ersten Teil der Arbeit wurde der weitere Abbau von Acetyl- und Propionyl-CoA in Cholat gewachsenen Zellen von Stamm Chol1 untersucht. In Zellextrakten von Acetat-gewachsenen Zellen war die spezifische Aktivität der Isocitratlyase, des Schlüsselenzyms des Glyoxylatzyklus, 50-fach erhöht gegenüber Extrakten von Cholat gewachsenen Zellen. Dies zeigt, dass der Glyoxylatzyklus in Cholat-gewachsenen Zellen von Stamm Chol1 nicht induziert ist und Acetyl CoA über den Citratzyklus abgebaut wird. Der Abbau von Propionyl CoA war in Cholat-gewachsenen Zellen induziert, während dies in Succinat-gewachsenen Zellen, die auch nicht für den Abbau von Cholat induziert sind, nicht der Fall war. Weiterhin war die spezifische Aktivität der 2-Methylcitratsynthase, des Schlüsselenzyms des 2 Methylcitratzyklus, in Cholat- und Propionat-gewachsenen Zellen annähernd identisch, während die Aktivität in Succinat-gewachsenen Zellen 10-fach niedriger war. Dies bedeutet, dass Propionat, welches während des Cholatabbaus ensteht, durch den 2-Methylcitratzyklus abgebaut wird. In Transposonmutanten, welche die Seitenkette von Cholat nicht abbauen können und daher kein Propionyl-CoA bilden war die spezifische Aktivität der 2 Methylcitratsynthase sehr viel niedriger. Folglich induziert die Bildung von Propionyl-CoA während des Cholatabbaus durch Stamm Chol1 den 2 Methylcitratzyklus.Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Abundanz und die Biochemie von cholatabbauenden Bakterien in der Littoralzone des Bodensees untersucht. Mithilfe von Mikrokosmos-experimenten konnten wir zeigen, dass die endogene Mikrobengemeinschaft im Littoralssediment des Bodensees unmittelbar in der Lage war, Cholat zu transformieren.Weiterhin wurden quantitative Anreicherungsexperimente mit verdünnten Sedimentproben des Littorals des Bodensees als Inokulum durchgeführt, welche zeigten, dass mehr als 1 % der kultivierbaren Bakterien in der Lage sind, Cholat abzubauen. Von diesen wurden fünfzehn Stämme als Reinkulturen isoliert, wobei drei weiter charakterisiert wurden. Der erste Stamm, Zoogloea sp. Stamm 1, ein β Proteobakterium, baut Cholat über den 9,10-Seco Weg ab, was sich an der vorrübergehenden Akkumulation der charakteristischen Intermediate dieses Weges, DHADD (7,12-Dihydroxy-1,4-androstadien-3,17-dion) und THSATD (3,7,12 Trihydroxy-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-dion), im Kulturüberstand zeigte. Der zweite Stamm, Pseudomonas sp. Stamm 9, ein γ Proteobakterium, akkumuliert während des Wachstums mit Cholat vorübergehend das ∆1/∆4-Monoen von 3-Ketocholat, 7,12 Dihydroxy-3-oxopregna-1,4-dien-20 carboxylat (DHOPDC) und das ∆1/∆4 Monoen von DHOPDC im Kulturüberstand. Dies deutet darauf hin, dass dieser Stamm ebenso den 9,10 Seco Weg für den Abbau von Cholat nutzt. Aktivitäten von Cholat-oxidierenden Enzymen (3-Hydroxysteroid Dehydrogenase [3-Hsd] und 3-Ketosteroid Dehydrogenase [3Ksdh]) wurden in beiden Stämmen nachgewiesen. Während des Cholatabbaus durch den dritten Stamm, Dietzia sp. Stamm 2, ein amyceliales Actinobakterium, akkumulierten zwei bisher unbekannte Produkte (X1 und X2) im Kulturüberstand, während die typischen Intermediate des 9,10-Seco Weges nicht auftraten. Die UV Spektren dieser beiden Produkte unterschieden sich stark von den Spektren der Intermediate des 9,10-Seco Weges. Obwohl die Bildung von ∆1,4 3-Ketocholat in Dietzia sp. Stamm 2 durch HPLC und LC-MS Analyse nachgewiesen wurde, konnten keine Aktivitäten von 3-Hsd und 3 Ksdh in zellfreiem Extrakt gemessen werden. Jedoch wurde Aktivität einer Choly-CoA-Ligase in in vitro Experimenten gemessen. Dietzia sp. Stamm 2 konnte nicht mit DHOPDC, 7,12 Dihydroxy-3-oxochola-1,4,22-trien-24-oat (DHOCTO), DHADD und THSATD wachsen, welche charakteristische Intermediate des 9,10-Seco Weges in Stamm Chol 1 während des Abbaus von Cholat darstellen. Darüber hinaus inhibierten diese Verbindungen den Cholatabau durch Stamm 2 und förderten die Bildung der Produkte X1 und X2.Diese Ergebnisse zeigen, dass Dietzia sp. Stamm 2 einen Abbauweg für Cholat nutzt, der sich von dem bekannten 9,10 Seco Weg unterscheidet. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass die Fähigkeit, Steroidverbindungen abzubauen innerhalb der kultivierbaren Bakterien in der Littoralzone des Bodensees sehr weit verbreitet ist. Die Entdeckung einen neuen Cholat-Abbauweges in Dietzia sp. Stamm 2 zeigt außerdem, dass die Diversität metabolischer Abbauwege für Steroidverbindungen bisher unterschätzt wurde.