Target Identification of a Small Molecule Rescuing Monastrol-Induced Spindle Defects : Can Lipid Metabolism Govern Cytoskeletal Architecture?

Al-Obaidi, Naowras

Target Identification of a Small Molecule Rescuing Monastrol-Induced Spindle Defects : Can Lipid Metabolism Govern Cytoskeletal Architecture?

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Al-Obaidi_0-347629.pdf(55.14 MB)

Date

2016

Publication type

Dissertation

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Die bipolare Konfiguration der mitotischen Spindel ist eine unabdingbare Voraussetzung für die fehlerfreie Verteilung der Chromosomen auf die beiden entstehenden Tochterzellen. In tierischen Zellen stellen Zentrosomen die Spindelpole dar, die hochdynamische Fasern des Zellskeletts, die Mikrotubuli, nukleieren und diese in die bipolare mitotische Struktur organisieren. Das Kinesin Eg5 erzeugt dabei die physikalische Kraft zur Trennung der Zentrosomen, indem es antiparallele Mikrotubuli gegeneinander versetzt. Folglich führt die zelluläre Inhibierung von Eg5-Aktivität durch Verbindungen wie Monastrol zur Ausbildung von monopolaren Spindeln und zu einer Hemmung der Zellteilung. In einem Screen zur chemisch-genetischen Unterdrückung des zellulären Erscheinungsbilds von Monastrol wurde die niedermolekulare Verbindung MAC1 identifiziert, welche es vermag, in Monastrol-behandelten Zellen die Bipolarität der Spindel wiederherzustellen. Ziel dieser Studie war es das zelluläre Zielprotein von MAC1 zu finden und den zugrunde liegenden molekularen Wirkmechanismus zu untersuchen. Mithilfe von Lebendzellmikroskopie wurde gezeigt, dass MAC1 funktionale bipolare Spindeln in Zellen mit eingeschränkter Eg5-Aktivität erzeugt und diesen ermöglicht, sich wieder zu teilen. Dieser Effekt ist sowohl in Monastrol-behandelten Zellen zu sehen als auch in Zellen, in denen Eg5 durch RNA-Interferenz (RNAi) entfernt wurde, wodurch eine genuine Mitwirkung im Spindelaufbau bestätigt wird. MAC1 verhindert nicht nur die Ausbildung von monopolaren Spindeln, sondern erzeugt auch Bipolarität der Spindel in Zellen mit vorgeformten monopolaren Spindeln. Mechanistisch wird ein solcher Übergang durch das Auftreten von zusätzlichen Mikrotubuliorganisationszentren begleitet und erfordert die Aktivität des ansonsten nicht-essenziellen Kinesins Kif15. Darüber hinaus induziert MAC1 azentrosomale Mikrotubulinukleation und durch einen unabhängigen genetischen Ansatz wurde gezeigt, dass azentrosomale Mikrotubulinukleation per se Resistenz gegenüber akuter Eg5-Hemmung vermitteln kann. Durch Entwicklung eines zweistufigen Syntheseverfahrens konnte eine Bibliothek von MAC1-Derivaten gewonnen werden, die anschließend in biologischen Systemen auf Aktivität getestet wurde, um eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen. Diese Untersuchungen ergaben sowohl potentere Verbindungen als auch eine aktive Verbindung, die an einer Festphase immobilisiert werden kann. Letztere konnte eingesetzt werden um mittels affinitätsbasierter Proteomik Enzyme der Fettsäureoxidation als Interaktionspartner zu identifizieren. Die Wechselwirkung mit D^3,5,D^2,4-Dienoyl-CoA-Isomerase (ECH1) konnte biochemisch validiert werden und es wird gezeigt, dass MAC1 durch Bindung des aktiven Zentrums ECH1 inhibiert. Eine Beteiligung von ECH1 zu den beschriebenen zellulären Effekten konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, da weder Unterdrückung der Proteinexpression mittels RNAi noch eine Genausschaltung auf Grundlage der CRISPR/Cas9-Technologie den zellulären Mikrotubuli-Phänotyp von MAC1 reproduzieren konnten. Untersuchungen der zellulären Fettsäureoxidation zeigten hingegen eine ausgeprägte Hemmung dieses Prozesses durch MAC1, bei der langkettige Acylcarnitinmetaboliten angereichert wurden. Dieser Phänotyp erinnert an Defekten im mitochondrialen Import von Fettsäuren durch das Carnitin-Acyltransferase-System und tatsächlich konnte dieser Effekt auf eine ausgeprägte Inhibierung der Carnitin-Acylcarnitin-Translokase (CACT) durch MAC1 zurückgeführt werden. Interessanterweise zeitgen Zellen, in denen CACT durch RNAi entfernt wurde, eine deutliche Synergie mit geringen MAC1-Dosen und MAC1-verwandte Mikrotubuliphänotypen. Dies legt eine Beteiligung von CACT im Wirkmechanismus von MAC1 nahe und eröffnet zudem die Möglichkeit, dass der Lipidstoffwechsel Mikrotubuliarchitektur und die Ausbildung von bipolaren Spindeln kontrollieren könnte. Diese Idee wird zusätzlich durch die Beobachtung bestärkt, dass eine RNAi-basierte Proteindepletion der Carnitin-O-Palmitoyltransferase 2 (CPT2), einem weiteren Protein des Carnitin-Acyltransferase-Systems, auch azentrosomale Mikrotubulinukleation hervorruft und eine bipolare Spindelbildung in Gegenwart von Monastrol erlaubt. Diese Studie bietet damit erste Hinweise zu einem unerwarteten Zusammenspiel des Fettsäurestoffwechsels und der Architektur des Zellskeletts. Es kann spekuliert werden, dass eine von langkettigen Acylcarnitinen ausgelöste Signalkaskade der zelluläre Vermittler sein könnte.

Subject (DDC)

570 Biosciences, Biology

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ISO 690

AL-OBAIDI, Naowras, 2016. Target Identification of a Small Molecule Rescuing Monastrol-Induced Spindle Defects : Can Lipid Metabolism Govern Cytoskeletal Architecture? [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

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Examination date of dissertation

June 27, 2016

University note

Konstanz, Univ., Doctoral dissertation, 2016

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Yes