Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone

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2011
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Dullius, Carlos Henrique
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Dissertation
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Zusammenfassung

Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Physiologie und Biochemie des anaeroben Abbaus von Isopropanol und Aceton, sowie auf die Aufklärung von Reaktionsmechanismen, welche am Acetonabbau in anaeroben Bakterien beteiligt sind. Untersucht wurden diese physiologischen und biochemischen Aspekte in syntrophen, methanogenen Anreicherungen, sulfatreduzierenden Bakterien und nitratreduzierenden Stämmen, welche dafür angereichert und isoliert wurden.


Die Abbaureaktionen von Isopropanol und Aceton wurden mit wachsenden Kulturen und in dichten Zellsuspensionen von methanogenen, syntrophen Co-Kulturen, welche auf Isopropanol oder Aceton angereichert und vorkultiviert wurden, nachgewiesen. Bakterielle Organismen aus den angereicherten Co-Kulturen, welche für den Abbau von Isopropanol und Aceton verantwortlich waren, wurden isoliert und phylogenetisch eingeordnet. Ein isolierter, isopropanolabbauender Organismus konnte durch Sequenzierung und Alignment des Gens der 16S rRNA als Methanospirillum hungatei identifiziert warden. Die Analyse der 16S rDNA eines unbekannten, acetonfermentierenden Organismus aus der angereicherten Co-Kultur KN-Act zeigte phylogenetische Ähnlichkeit mit einem Organismus der Gattung Desulfosporosinus.


In Abbauexperimenten mit wachsenden Kulturen und dichten Zellsuspensionen konnten mögliche Abbauwege, welche am anaeroben Isopropanol- und Acetonabbau beteiligt sind, nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines bereits vermuteten, membrangebundenen, von Natriumionen abhängigen Transportsystems, welches die Energie zur anaeroben Aktivierung des Acetonmoleküls zur Verfügung stellt, konnte gezeigt werden. Der Abbau von Acetat durch methanogene Bakterien in der Co-Kultur KN-Act war Natrium-abhängig. Eine Akkumulierung von Acetat im Kulturmedium fand nur statt, wenn der methanogene Partner durch Bromethansulfonat gehemmt wurde.


Ein Stamm von Desulfococcus biacutus wurde verwendet, um die acetonabbauenden Reaktionswege in sulfatreduzierenden Bakterien aufzuklären. Das Einfügen eines Kohlenstoffmonoxidmoleküls in organische Verbindungen wie Aceton (Reppe Carbonylierung von Alkenen) erschien plausibel für den anaeroben Acetonabbau durch D. biacutus. Das Vorhandensein von spezifisch induzierten Enzymen, welche im Acetonmetabolismus beteiligt sind, und die mögliche Beteiligung eines Carbonylierungssystems konnte in zellfreien Extrakten von D. biactus nach anaerober Kultivierung mit Aceton und Sulfat nachgewiesen werden. Zwei weitere Strategien wurden in dichten Zellsuspensionen von D. biacutus nachgewiesen. Eine davon ist der Anstieg der Acetonabbauraten durch Zugabe von Fumarat mit der nachweislichen Bildung von 2-Oxopropylsuccinat ähnlich wie in der β-Oxidation von Pyruvat und Succinat.


Eine Aceton carboxylierende Reaktion wurde in zellfreien Extrakten aus drei verschiedenen nitratreduzierenden Stämmen nachgewiesen: Paracoccus denitrificans, P. pantotrophus, und dem neu isolierten, acetonabbauenden, nitratreduzierenden Stamm KN Bun08. Anfangs wurden in vitro Experimente mit zellfreiem Rohextrakt aus nitratreduzierenden Organismen, welche zuvor anaerob auf Aceton und Nitrat kultiviert wurden, gemacht. Für den Nachweis der Acetoncarboxylierungsreaktion wurde ein modifizierter, mit den Hilfsenzymen Adenylatkinase (EC 2.7.4.3), auch Myokinase genannt, Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40) and Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27) gekoppelter Enzymtest entwickelt, in dem NADH oxidiert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Acetoncarboxylierungsreaktion in zellfreien Extrakten mit angereicherter Acetoncarboxylase aus auf Aceton gewachsenen Zellen von P. denitrificans, P. pantotrophus und Stamm KN Bun08 zu sehen war. Die Aktivität der ATP-abhängigen Acetoncarboxylase wurde durch die ATP-Bildung und NADH-Oxidation in kontinuierlichen, spektrophotometrischen Untersuchungen nach chromatographischen Anreicherungen der Acetoncarboxylase mit zwei Anreinigungsschritten mit einer DEAE-Sepharose Säule nachgewiesen. Enzymaktivitäten von 0,4; 0,03 und 0,2 U/mg Protein wurden nachweislich in Extrakten aus P. denitrificans, P. pantotrophus and KN-Bun08 nach der zweiten Aufreinigung mit der DEAE-Sepharose Säule gemessen. Die Aktivität war abhängig von der Aceton- und ATP- Zugabe und hing zusammen mit dem Proteingehalt im Reaktionsmix. Nach dem letzten Aufreinigungsschritt konnten drei Untereinheiten der Acetoncarboxylase (Alpha, Beta und Gamma Untereinheiten) mit SDS-PAGE sichtbar gemacht werden und mit Hilfe der Massenspektroskopie identifiziert werden.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

The present work focused on the physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone and the elucidation of reactions and mechanisms which are involved in acetone degradation by anaerobic bacteria. For the investigation of physiological and biochemical aspects that are involved in these anaerobic degradation processes, syntrophic methanogenic enrichments, sulfate-reducing bacteria and nitrate-reducing strains were enriched and isolated.


Isopropanol and acetone degradation was investigated in growing cultures and in dense cell suspensions of methanogenic syntrophic co-cultures enriched and pre-cultivated with isopropanol or acetone. Bacterial organisms present in the enrichment co-cultures which are responsible for degradation of isopropanol and acetone were isolated and identified. An isolated isopropanol-degrading organism was identified as Methanospirillum hungatei and the analysis of the 16S rDNA of the unknown acetone fermenting organism present in the enrichment co-culture KN-Act indicated high similarity with an organism of the genus Desulfosporosinus.


In biodegradation experiments with growing cultures or dense cell suspensions possible metabolic pathways which are involved in the anaerobic isopropanol and acetone degradation could be demonstrated. The existence of a supposed membrane-bounded, sodium ion (Na+)-dependent system which could provide the energy for the anaerobic acetone activation was determined. Acetate degradation by the methanogenic bacteria in the co-culture KN-Act was independent of the presence of sodium-ions. Accumulation of acetate in the medium was observed only when the methanogenic partner was inhibited by bromoethane sulfonate.


A strain of Desulfococcus biacutus was used for the investigation of the acetone-degrading pathways applied by sulfate-reducing bacteria. The incorporation of a carbon monoxide molecule (Reppe carbonylation of alkenes) in organic compounds as acetone appeared to be feasible for anaerobic acetone degradation by D. biacutus. The occurrence of specifically induced enzymes which are involved in the acetone metabolism and the possible involvement of a carbonylation system was investigated in cell-free extracts of D. biactus after anaerobic growth with acetone and sulfate. Two further strategies were investigated in dense cell suspensions of D. biacutus. One is the increasing of acetone degradation rates parallel to the addition of fumaric acid on acetone with the respective formation of 2-oxopropyl succinate similar to the beta-oxidation of pyruvate and succinate.


The detection of an acetone carboxylation reaction was investigated in cell-free extracts of three different nitrate-reducing strains: Paracoccus denitrificans, P. pantotrophus, and the newly isolated acetone-degrading, nitrate-reducing strain KN Bun08. Initially, in vitro experiments were performed with crude cell-free extracts of the nitrate-reducing organisms mentioned above after anaerobic growth on acetone with reduction of nitrate. For detection of the acetone carboxylation reaction a coupled continuous, a modified enzyme test based on the use of the help enzymes Adenylate kinase (EC 2.7.4.3), also called Myokinase, Pyruvate kinase (EC 2.7.1.40) and Lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27) with the concomitant oxidation of NADH was used. The results show that an acetone carboxylation reaction was detected in cell-free extracts with the enriched acetone carboxylase enzyme from acetone grown cells of P. denitrificans, P. pantotrophus and strain KN Bun08. The activity of the ATP-dependent acetone carboxylase enzyme was measured by the formation of ADP and by the oxidation of NADH in a continuous spectrophotometric assay after chromatographic enrichment of the acetone carboxylase enzyme with two enrichment steps on a DEAE-sepharose column. Enzyme activities of 0.4, 0.03 and 0.2 U/mg protein were measured, respectively, for P. denitrificans, P. pantotrophus and KN-Bun08 after the second enrichment with DEAE-sepharose column. The activity was dependent on the addition of acetone and ATP, and was correlated with the amount of protein in the reaction mixture. After the last enrichment step, three subunits (alpha, beta and gamma subunits) of the acetone carboxylase enzyme were visible with SDS-PAGE and proteins were identified by mass spectrophotometry.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Anaerobic degradation of isopropanol and acetone
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690DULLIUS, Carlos Henrique, 2011. Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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July 5, 2011
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