Konfokale Mikroskopie mit neuartigen Femtosekunden-Lichtquellen

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anwendung Femtosekunden-Faserlaser in der Mikroskopie. In der konfokalen Mikroskopie fehlt es nach wie vor an stabilen, einfach zu bedienenden Femtosekunden-Lichtquellen.Faserlaser-Systeme können diese Lücke schließen, denn sie sind sehr robust. Des Weiteren zeichnen sie sich durch hervorragende Stabilität aus und sind durch verschiedene Möglichkeiten der Frequenzkonversion sehr flexibel. Durch das parallele Hochverstärken in Mehrarm-Systemen eignen sie sich prinzipiell auch für Techniken wie STED - und CARS -Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion und Coherent Anti-Stokes RamanScattering) [Kra09], bei denen verschiedene synchronisierte Laserstrahlen erforderlich sind. Diese Techniken benötigen bisher komplizierte und teure Lasersysteme und könnten durch einfachere Lichtquellen eine weite Verbreitung finden. Dabei zeichnen sich die Faserlaser durch ihre exzellenten Rauscheigenschaften und die nahezu perfekte Synchronisation mehrerer Verstärkerarme aus [Adl07]. Da es sich bei den verwendeten Systemen um gepulste Quellen handelt, können sie auch für Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen (FLIM) eingesetzt werden.Nach einer kurzen Einführung wird der Aufbau eines Konfokalmikroskops mit einem Femtosekunden-Er:Faserlaser als Lichtquelle beschrieben. Dieses System besticht durch seine Vielseitigkeit, da die Lichtquelle sowohldie lineare als auch die nichtlineare konfokale Anregung in verschiedenen Wellenlängenbereichen ermöglicht. Die hervorragenden Rauscheigenschaften des Systems wurden demonstriert und mit anderen Quellen verglichen.Um die Ausgangsleistung des Systems zu steigern, wurde ein Yb:Faserverstärker entwickelt. Dabei kamen Multimoden-gepumpten Doppelkernfasern zum Einsatz. Parallel dazu wurde ein Singlemode-Verstärker aufgebaut. Beide Verstärker wurden mit dem in einer hoch-nichtlinearen Faser generierten Superkontinuum geseedet. Dieser neuartige Ansatz stellt eine ausgezeichnete Femtosekunden-Seed-Quelle für Yb-dotierte Hochleistungsverstärker dar.Der Schwerpunkt der Anwendung des entwickelten Aufbaus lag in der konfokalen Photomanipulation lebender Zellen. Dabei wurde die zelluläre DNA mit hoher räumlicher Auflösung über Multiphotonen-Absorption geschädigt. Zunächst wurde die räumliche Ausdehnung der induzierten DNA-Läsionen untersucht und gezeigt, dass das geschädigte Volumen im sub-Femtoliter-Bereich liegt. In den zuvor von anderen Gruppen durchgeführten Experimenten wurde in einem Wellenlängenbereich zwischen 750 nm und 800 nm bestrahlt. Dabei ist immer die fehlende Selektivität bemängelt worden, da sowohl Photoprodukte als auch oxidative Schäden erzeugtwerden. Diese Arbeit stellt Ergebnisse vor, die belegen, dass es möglich ist, bei 1050 nm spezfisch DNA-Strangbrüche zu induzieren. Der quantitative Vergleich zwischen der Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 775 nm und bei 1050 nm zeigte, dass bei letzterer keine UV -Photoprodukte nachweisbar sind. Dies wurde über immuncytochemische Färbungen ermittelt. Durch diese Beobachtungen war es erstmals möglich, Bedingungen zufinden, die selektiv Strangbrüche induzieren. Außerdem wurde erstmals das Schadensspektrum bei unterschiedlichen Wellenlängen systematisch untersucht.Der letzte Teil der Arbeit konzentriert sich auf XPC, ein Protein, welches die Identfizierung von UV -Photoprodukten in der Nukleotidexzissionsreparatur übernimmt [Cam09]. Zusammen mit der Arbeitsgruppe um Professor H. Nägeli in Zürich konnten wir den Bereich des Proteins identfizieren, der für die Bindung an die Läsion zuständig ist. Dazu wurden verschiedene XPC-Fragmente in lebenden Zellen exprimiert. Nach der Schädigung der DNA in einem kleinen Volumen wurde die Rekrutierung an den Ort des Schadens beobachtet. Mit dieser Technik konnten wir einen minimalen Sensor für DNA-Läsionen identfizieren.Zum Abschluß wird die quantitative Auswertung und Simulation der Experimente besprochen. Diese Versuche stehen allerdings erst am Anfang.Dennoch kann dabei der Einfluss einzelner Parameter auf die Akkumulation nachvollzogen werden. Für zukünftige Simulationen sollten jedoch einige Parameter zusätzlich bestimmt werden. Insbesondere fehlen bisherquantitative Angaben über die Konzentrationen der einzelnen Proteine in den Zellen unter physiologischen Bedingungen.Der vorgestellten Leistungsparameter jedoch in den meisten Fällen.