A direct and functional interaction between the trimeric G protein Go and Rab5 in G proteincoupled receptor signaling

Abstract

Die Internalisierung und der intrazelluläre Transport von GPCRs ist ein hoch regulierter und dynamischer Prozess, der für Desensibilisierung, Phosphorylierung und Resensibilisierung vieler GPCR entscheidend ist. Viele GPCRs erreichen durch die durch Rab5 gesteuerte Internalisierung ein starkes Signal, da sie den Rezeptor und seine Effektoren in die Nähe der nächsten Komponenten der Signalkaskade bringen. Normalerweise wird das Signal dadurch beendet, dass der Rezeptor zu multivesikulären Körperchen gebracht wird. Das schnelle Recyclen durch Rab4 erlaubt mehrere Zyklen von kürzerer GPCR Aktivierung und starke Signale an der Membran. Im Gegensatz dazu führt das langsamere Rezeptorrecycling durch Rab11 zu einem Signal, das tiefer in das Zytoplasma reicht. Lange Zeit wurde die Funktion von Rab Proteinen, Vesikel von einer zur anderen Membran zu transferieren, als eher passiv angesehen. Unsere Ergebnisse zeigen nun, dass Rezeptoren der Frizzled Familie in vitro direkt mit Rab5 interagieren können und diese GTPase in Drosophila Zellen aktivieren können. Außerdem konnten wir zeigen, dass der Prozess der Frizzled Internalisierung von Gαo abhängig ist. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Gαo in vitro direkt an Rab5 und Rab4 bindet und dass es Rab5 durch Rekrutierung des Proteins an die Membran aktiviert. Dies ist der erste Beweis einer direkten und funktionellen Interaktion eines Gαo-Proteins mit einer Rab-GTPase. Wir zeigen das Mitwirken von Rab4, Rab5 und Rab11 in der planaren Zellpolarität und im Wingless-Frizzled Signaltransduktionsweg in Drosophila und schlagen ein Model für die Regulierung beider Signalwege vor. Wir schlagen vor, dass die durch Frizzled hervorgerufenen Aktivierung von Gαo zur Rekrutierung von Rab5 in die Nähe der Frizzeld-Rezeptoren führt, wodurch die Endozytose des Rezeptors katalysiert und daher die Signalintensität amplifiziert wird. Danach definieren unterschiedliche Transportwege der Frizzled Komplexe die Spezifität der Aktivierung von Wingless oder planaren Zellpolarität Frizzled-Signalwege. Unsere Beobachtungen bringen Erkenntnisse für den Frizzled- Signaltransduktionsweg und seine Regulierung, ebenso wie für die gesamte GPCR-Biologie.Zusätzlich haben wir einen in vitro Assay etabliert, um G-Proteine untersuchen zu können und wir konnten zeigen, dass Europium-GTP in den gleichen Experimenten, in denen traditionell radioaktive Nukleotide eingesetzt werden, verwendet werden kann. Daher vermeidet dieser Assay nicht nur die Nachteile von radioaktiven GTPγS, die mit der Verwendung von radioaktiven Komponenten und radioaktivem Abfall einhergehen und daher in der modernen Laborpraxis unerwünscht sind, sondern ermöglicht auch Experimente im "high-throughput" Format durchzuführen. Unsere Methode verwendet die zeitauflösende Fluorometrie, eine etablierte Technologie, die die fluoreszierenden Eigenschafen von Lanthanoidchelaten verwendet, als leistungsfähige Alternative für Assays mit radioaktiven Isotopen