Analysis of the topology and function of the c subunit of the Helicobacter pylori F1F0-ATPase

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2003
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Schmidt-Petri, Tessa
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Analyse der Topologie und Funktion der c-Untereinheit der F1F0-ATPase von Helicobacter pylori
Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

Das Bakterium Helicobacter pylori ist heute als ein humanes Pathogen anerkannt, das unterschiedlichste Krankheitsbilder in Magen und Darm verursacht. Die verursachten Beschwerden reichen von entzündlicher Gastritis und Geschwüren hin zu MALT-Lymphomen. Außerdem stellt eine H. pylori Infektion einen Risikofaktor für die Entwicklung von Magenkrebs dar.
Die Forschung an H. pylori möchte vor allem klären, wie dieser Keim im sauren Magen überlebt. Die Identifizierung der Mechanismen, die ein Überleben im sauren Milieu ermöglichen, können zur Entdeckung neuer Angriffspunkte für Medikamente beitragen.
In dieser Arbeit wurde die c-Untereinheit der F1F0-ATPase von H. pylori untersucht. Die F1F0-ATPase, auch ATP-Synthase genannt, nutzt den elektrochemischen Protonengradienten über der inneren bakteriellen Membran, um ATP zu bilden. Unter veränderten Bedingungen kann diese Reaktion auch umgekehrt werden, so daß Protonen unter ATP-Verbrauch aus der Zelle hinaus gepumpt werden. Die F1F0-ATPase ist also am Protonenhaushalt der Zelle beteiligt. Die c-Untereinheit bildet einen Teil des Kanals durch die innere Membran und ist direkt am Protonenfluß beteiligt. Einige Besonderheiten unterscheiden die c-Untereinheit von H. pylori von den c-Untereinheiten der meisten anderen Organismen.
In den meisten Organismen sind die atp Gene in einem Operon angeordnert. Bei H. pylori sind die Gene, die für die Untereinheiten a und c kodieren, nicht in diesem Operon enthalten. Die Untereinheiten a und c bilden den Protonenkanal und diese veränderte Anordnung deutet auf veränderte Regulation dieser Gene in H. pylori hin.
Zudem wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, daß die H. pylori c-Untereinheit drei Transmembrandomänen besitzt. Damit unterscheidet sie sich deutlich von den c-Untereinheiten der meisten anderen Organismen, für die eine helicale Haarnadel-Struktur mit zwei Transmembrandomänen beschrieben wird. Diese Struktur wurde sowohl mit einem In vitro System als auch mit einem In vivo System nachgewiesen. Im ersten System wurde die Translokation über mikrosomale Membranen analysiert, während bei der zweiten Methode Fusionsproteine von potentiellen Membrandomänen mit alkalischer Phosphatase in E. coli exprimiert wurden. Beide Systeme haben gezeigt, das bei der H. pylori c-Untereinheit der N-Terminus im Cytoplasma und der C-Terminus im Periplasma liegt. Durch den zusätzlichen N-Terminus entsteht eine periplasmatische Domäne, die mehrere protonierbare Aminosäurereste enthält und daher an der Regulation der c-Untereinheit beteiligt sein könnte: H18, D19, D27, K29 und Y31. Außerdem konnte gezeigt werden, daß im H. pylori Stamm G1.1, der im Tiermodell infektiös ist, einen zusätzliche Glutaminsäure an Position 23 vorhanden ist.
Das Ausschalten des Gens atpE, welches für die c-Untereinheit kodiert, war nicht möglich. Während bei der Kontrolle mehr als 6000 Mutanten erhalten wurden, waren es beim Versuch mit atpE nur 2 bis 43, je nach Stamm. Allerdings stellte sich bei der PCR Analyse heraus, daß in der genomischen DNA immer noch die Wildtyp-Sequenz vorhanden war. Das Gen atpE wurde folglich als essentiell unter Standardbedingungen klassifiziert.
Weiterhin wurde versucht, das H. pylori atpE Gen mit der Sequenz des E. coli atpE Gens auszutauschen. Obwohl die Expression des E. coli Gens nachgewiesen werden konnte, war dieser Austausch nicht möglich. Selbst wenn der N-Terminus der H. pylori Sequenz an die E. coli Sequenz fusioniert wurde, konnten die Gene nicht ausgetauscht werden. Das deutet darauf hin, daß die zweite und dritte Membrandomäne für die Funktionalität der c-Untereinheit notwendig sind. Allerdings konnten einige wenige H. pylori Mutanten in einem Stamm generiert werden, die eine verkürzte Form des atpE Gens exprimieren. Trotzdem schliessen diese Versuche nicht aus, daß der N-Terminus, vor allem unter sauren Bedingungen, notwendig für das Überleben von H. pylori ist.
Die Funktion des Histidin-Rests in der periplasmatischen Domäne wurde anhand von Mutanten untersucht, in denen Histidin gegen Glycin ausgetauscht wurde. Diese Mutanten zeigen ein verändertes Verhalten im sauren Milieu, was auf eine regulatorische Funktion hinweist.
Nachdem die Topologie der c-Untereinheit bestimmt ist, sind weiterführende Versuche notwendig, um die exakte Funktion der H. pylori c-Untereinheit aufzuklären. Dazu müssen auch die anderen protonierbaren Aminosäuren in der periplasmatischen Domäne untersucht werden, ebenso wie die Mutanten mit dem verkürzten atpE.
Die c-Untereinheit besitzt mehrere spezielle Eigenschaften und ist daher ein interessantes Protein, welches eine wichtige Rolle im Protonenhaushalt von H. pylori haben könnte.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Helicobacter pylori is recognized today as a human pathogen responsible for several disorders in the human stomach and intestine. The diseases range from chronic gastritis and ulcer to MALT-Lymphoma and a risk factor for gastric cancer>.
It is important to understand the mechanisms that allow survival in the acidic human stomach, as well as to identify specific proteins involved herein for the discovery of new targets and the development of selective drugs against H. pylori.
In this study, the c subunit of the F1F0-ATPase from H. pylori has been analysed. The F1F0-ATPase or ATP-synthase uses an electrochemical H+ gradient across the cytoplasmic membrane for the generation of ATP. On the other hand, protons can be pumped out of the cytoplasm during hydrolysis of ATP. Thus, the F1F0-ATPase is involved in H+ metabolism. The c subunit of this multimeric enzyme is directly involved in proton translocation across the membrane and thus might play a role in acid survival. Several characteristics were identified that distinguish the H. pylori F1F0-ATPase from most other organisms.
The genetic organization of the atp genes is found to be an operon in most organisms. In H. pylori, the genes for the subunits a and c that form the proton-conducting channel are found separated from the remaining operon. Therefore, the varied regulation of gene expression might influence the mechanism of proton translocation.
Here it is shown for the first time that the H. pylori c subunit contains three membrane spanning segments instead of the usual two segments found in most other organisms.
This has been demonstrated with an in vitro transcription and translation system with microsomal membranes and in an in vivo system, where fusion proteins with potential transmembrane sequences of H. pylori atpE with alkaline phosphatase were expressed in E. coli. Both systems could show that an additional transmembrane domain is located in the N-terminal region of the H. pylori c subunit and that the N-terminus is located in the cytoplasm. The additional N-terminal region creates unique structural features and a periplasmic loop is found between the first and second transmembrane domain. This periplasmic loop has several protonatable amino acid residues that might be involved in regulation of the H. pylori c subunit in an environment with varying pH: H18, D19, D26, K29 and Y31. It was also shown that strain G1.1, which is infectious in the gerbil animal model, exhibits an additional glutamic acid at position 23.
Knockout of the atpE gene, which encodes the c subunit, was impossible. Very few viable clones were detected. For instance, only two potential mutants were received in strain 69A compared to the control with more than 6000 mutants obtained. These potential mutants still contained the wild type atpE sequence when genomic DNA was analysed by PCR. Thus, the atpE gene is essential for H. pylori under standard growth conditions.
The construction of mutants revealed that the E. coli c subunit cannot replace the H. pylori c subunit. Even when the H. pylori N-terminus was added to the E. coli sequence, it was not possible to exchange the H. pylori atpE gene against the E. coli variant. This indicates a crucial role of the conserved second and third transmembrane segment, corresponding to the complete E. coli c subunit, for protein assembly and function.
On the other hand, it has also been shown that a mutant with a truncated version of the H. pylori atpE gene is viable. Nevertheless, an essential role of the additional N-terminal segment cannot be excluded because the truncation was only possible in H. pylori strain 69A. Additionally, a specialized role of the N-terminal segment in survival in an acidic environment is conceivable.
The involvement of the histidine residue at position 18 in the periplasmic loop of the H. pylori c subunit under varying pH conditions was examined. Histidine was exchanged for glycine and the mutants exhibited a different behaviour in the acidic environment, indicating that the exchange of histidine affects control of cytoplasmic and periplasmic pH.
Further analysis is necessary to elucidate the function of the H. pylori c subunit. The amino acids in the periplasmic loops have to be examined for their influence on the survival in an acidic environment. One candidate for adaptation to the acidic environment appears to be histidine at position 18 in the periplasmic loop of the H. pylori c subunit.
Moreover, the characteristics of the truncated mutants have to be investigated.
The c subunit is a promising target due to its unique structure and the involvement in proton translocation. Proton metabolism has to be differentially regulated in H. pylori in order to enable the pathogen to inhabit the human stomach, its ecological niche.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Membrandomänen, c-Untereinheit, Helicobacter pylori, F-type-ATPase, c subunit, membrane domain, topology
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ISO 690SCHMIDT-PETRI, Tessa, 2003. Analysis of the topology and function of the c subunit of the Helicobacter pylori F1F0-ATPase [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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October 22, 2003
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