Analysis of the topology and function of the c subunit of the Helicobacter pylori F1F0-ATPase

Abstract

Das Bakterium Helicobacter pylori ist heute als ein humanes Pathogen anerkannt, das unterschiedlichste Krankheitsbilder in Magen und Darm verursacht. Die verursachten Beschwerden reichen von entzündlicher Gastritis und Geschwüren hin zu MALT-Lymphomen. Außerdem stellt eine H. pylori Infektion einen Risikofaktor für die Entwicklung von Magenkrebs dar.Die Forschung an H. pylori möchte vor allem klären, wie dieser Keim im sauren Magen überlebt. Die Identifizierung der Mechanismen, die ein Überleben im sauren Milieu ermöglichen, können zur Entdeckung neuer Angriffspunkte für Medikamente beitragen.In dieser Arbeit wurde die c-Untereinheit der F1F0-ATPase von H. pylori untersucht. Die F1F0-ATPase, auch ATP-Synthase genannt, nutzt den elektrochemischen Protonengradienten über der inneren bakteriellen Membran, um ATP zu bilden. Unter veränderten Bedingungen kann diese Reaktion auch umgekehrt werden, so daß Protonen unter ATP-Verbrauch aus der Zelle hinaus gepumpt werden. Die F1F0-ATPase ist also am Protonenhaushalt der Zelle beteiligt. Die c-Untereinheit bildet einen Teil des Kanals durch die innere Membran und ist direkt am Protonenfluß beteiligt. Einige Besonderheiten unterscheiden die c-Untereinheit von H. pylori von den c-Untereinheiten der meisten anderen Organismen.In den meisten Organismen sind die atp Gene in einem Operon angeordnert. Bei H. pylori sind die Gene, die für die Untereinheiten a und c kodieren, nicht in diesem Operon enthalten. Die Untereinheiten a und c bilden den Protonenkanal und diese veränderte Anordnung deutet auf veränderte Regulation dieser Gene in H. pylori hin.Zudem wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, daß die H. pylori c-Untereinheit drei Transmembrandomänen besitzt. Damit unterscheidet sie sich deutlich von den c-Untereinheiten der meisten anderen Organismen, für die eine helicale Haarnadel-Struktur mit zwei Transmembrandomänen beschrieben wird. Diese Struktur wurde sowohl mit einem In vitro System als auch mit einem In vivo System nachgewiesen. Im ersten System wurde die Translokation über mikrosomale Membranen analysiert, während bei der zweiten Methode Fusionsproteine von potentiellen Membrandomänen mit alkalischer Phosphatase in E. coli exprimiert wurden. Beide Systeme haben gezeigt, das bei der H. pylori c-Untereinheit der N-Terminus im Cytoplasma und der C-Terminus im Periplasma liegt. Durch den zusätzlichen N-Terminus entsteht eine periplasmatische Domäne, die mehrere protonierbare Aminosäurereste enthält und daher an der Regulation der c-Untereinheit beteiligt sein könnte: H18, D19, D27, K29 und Y31. Außerdem konnte gezeigt werden, daß im H. pylori Stamm G1.1, der im Tiermodell infektiös ist, einen zusätzliche Glutaminsäure an Position 23 vorhanden ist.Das Ausschalten des Gens atpE, welches für die c-Untereinheit kodiert, war nicht möglich. Während bei der Kontrolle mehr als 6000 Mutanten erhalten wurden, waren es beim Versuch mit atpE nur 2 bis 43, je nach Stamm. Allerdings stellte sich bei der PCR Analyse heraus, daß in der genomischen DNA immer noch die Wildtyp-Sequenz vorhanden war. Das Gen atpE wurde folglich als essentiell unter Standardbedingungen klassifiziert.Weiterhin wurde versucht, das H. pylori atpE Gen mit der Sequenz des E. coli atpE Gens auszutauschen. Obwohl die Expression des E. coli Gens nachgewiesen werden konnte, war dieser Austausch nicht möglich. Selbst wenn der N-Terminus der H. pylori Sequenz an die E. coli Sequenz fusioniert wurde, konnten die Gene nicht ausgetauscht werden. Das deutet darauf hin, daß die zweite und dritte Membrandomäne für die Funktionalität der c-Untereinheit notwendig sind. Allerdings konnten einige wenige H. pylori Mutanten in einem Stamm generiert werden, die eine verkürzte Form des atpE Gens exprimieren. Trotzdem schliessen diese Versuche nicht aus, daß der N-Terminus, vor allem unter sauren Bedingungen, notwendig für das Überleben von H. pylori ist.Die Funktion des Histidin-Rests in der periplasmatischen Domäne wurde anhand von Mutanten untersucht, in denen Histidin gegen Glycin ausgetauscht wurde. Diese Mutanten zeigen ein verändertes Verhalten im sauren Milieu, was auf eine regulatorische Funktion hinweist.Nachdem die Topologie der c-Untereinheit bestimmt ist, sind weiterführende Versuche notwendig, um die exakte Funktion der H. pylori c-Untereinheit aufzuklären. Dazu müssen auch die anderen protonierbaren Aminosäuren in der periplasmatischen Domäne untersucht werden, ebenso wie die Mutanten mit dem verkürzten atpE.Die c-Untereinheit besitzt mehrere spezielle Eigenschaften und ist daher ein interessantes Protein, welches eine wichtige Rolle im Protonenhaushalt von H. pylori haben könnte.