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Mechanistische Studien der humanen DNA-Polymerase beta mittels chemischer Sonden und gerichteter Evolution

Mechanistische Studien der humanen DNA-Polymerase beta mittels chemischer Sonden und gerichteter Evolution

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Prüfsumme: MD5:23fdf497674bb8b7edc96207f7e16387

DI PASQUALE, Francesca, 2008. Mechanistische Studien der humanen DNA-Polymerase beta mittels chemischer Sonden und gerichteter Evolution

@phdthesis{Di Pasquale2008Mecha-9950, title={Mechanistische Studien der humanen DNA-Polymerase beta mittels chemischer Sonden und gerichteter Evolution}, year={2008}, author={Di Pasquale, Francesca}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

application/pdf 2011-03-24T18:15:31Z 2008 Mechanistische Studien der humanen DNA-Polymerase beta mittels chemischer Sonden und gerichteter Evolution Di Pasquale, Francesca deu Di Pasquale, Francesca Die Erbinformationen aller Lebewesen sind in Form von Genen festgehalten. Die Weitergabe dieses Erbguts von einer Generation zur nächsten ist die Lebensbasis aller Organismen. Dafür ist ein Set von verschiedenen Enzymen notwendig, unter denen die DNA-Polymerasen eine Schlüsselrolle einnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Substratakzeptanz von DNA-Polymerasen untersucht.<br />Im ersten Teil der Arbeit wurden die sterischen Zwänge am aktiven Zentrum unterschiedlicher DNA-Polymerasen analysiert. Sowohl der Einbau von Nukleotiden als auch die anschließende Verlängerung wurden mithilfe chemisch modifizierter Sonden untersucht. Schon in früheren Arbeiten von Marx, Summerer und Strerath wurde festgestellt, dass Nukleosidtriphosphate, die eine Alkylgruppe an der 4 -C-Position der Desoxyriboseeinheit tragen, als Sonde eingesetzt werden können, um die Rigidität der aktiven Zentren von DNA-Polymerasen zu untersuchen. In dieser Studie wurden kinetische Untersuchungen der humanen DNA-Polymerase beta (Pol beta) und des Klenow Fragments der E. coli DNA-Polymerase I (KF(exo-)) durchgeführt, die deutliche Unterschiede in den sterischen Einschränkungen zeigten, die beim Zucker-Rückgrat des eingehenden Nukleotides und des 3´-Primerterminus wirken. Beide Enzyme wurden durch die Modifikation am eintretenden Nukleotid beeinträchtigt, allerdings zeigte die Pol beta einen stärkeren Effekt als das KF(exo-). Da die Pol beta eine ca. 10-fach geringere Genauigkeit in der Inkorporation von Nukleotiden im Vergleich zum KF(exo-) besitzt, würde man nach der Theorie der "active site tightness" eine rigidere Bindungstasche beim KF(exo-) als bei der Pol beta erwarten. Die Tatsache, dass das KF(exo-) die modifizierten Nukleotide besser einbauen konnte als die Pol beta, weist auf eine größere Flexibilität im aktiven Zentrum hin, zumindest in der Interaktion mit dem Zucker. Bei der Untersuchung der Interaktionen am 3´-Primerterminus konnten Unterschiede in der Verlängerungseffizienz der alkylierten Primer festgestellt werden, die um mehrere Größenordnungen variierten. Die beiden untersuchten Enzyme zeigten ein entgegengesetztes Verhalten, als sie die eingesetzten sterischen Sonden am Primerterminus im Vergleich zum eintretenden dNTP prozessierten. In der Tat konnte die Pol beta die Primer/Templat-Komplexe gut prozessieren, die am 3´-Primerterminus die Modifikation trugen. Die Enzymkonformation in der Pol beta konnte offensichtlich die Störung durch sterische Sonden besser tolerieren als die des KF(exo-). Dieser Teil der Arbeit bietet die ersten experimentellen Hinweise, dass bei den untersuchten Polymerasen unterschiedliche sterische Zwänge auf den Nukleotiden am 3´-Primerterminus wirken. Diese Erkenntnisse stimmen mit den experimentellen Daten über die Unterschiede in der "misalignment fidelity" überein. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die sterischen Zwänge direkt in der Genauigkeit von DNA-Polymerasen involviert sind.<br />Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Screeningsystem entwickelt, um eine Mutante der Pol beta zu finden, die eine erhöhte Überlesefunktion über DNA-Schäden vorweist. Das Ziel dieser Evolution war, einen Beitrag zur Klärung des Mechanismus zu leisten, der an der Basis der Bypass-Fähigkeit mancher DNA-Polymerasen liegt. Durch gerichtete Evolution und Screening einer randomisierten Bibliothek konnte eine Mutante isoliert werden, die eine verbesserte Überlesefunktion von abasischen Stellen zeigte. Die isolierte Mutante, 5P20 benannt, wurde anschließend biochemisch charakterisiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass diese Mutante die Verlängerung nach dem Einbau gegenüber einer abasischen Stelle 160-fach besser im Vergleich zum Wildtyp durchführen konnte.<br />Die Analyse der Sequenz dieser neuen Variante zeigte vier Mutationen. Durch die Untersuchung aller möglichen Kombinationen dieser vier Mutationen konnte gezeigt werden, dass zwei dieser Mutationen ausreichend für die Entstehung der neuen Eigenschaft waren und dass die weiteren beiden keinen negativen Einfluss darauf hatten. Mechanistic studies of human DNA polymerase beta by means of chemical probes and directed evolution 2011-03-24T18:15:31Z deposit-license

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