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Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

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Prüfsumme: MD5:3a51257dc6236b9856600ab897b91caa

PERDIVARA, Irina, 2009. Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

@phdthesis{Perdivara2009Struc-9700, title={Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry}, year={2009}, author={Perdivara, Irina}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

eng Perdivara, Irina Perdivara, Irina 2009 application/pdf Autoimmunerkrankungen haben in den letzten Jahren zunehmende medizinische Bedeutung aufgrund der zunehmeden Zahl individueller Erkrankungen und der geringen Kenntnisse über Krankheitsursache(n) erlangt. Eindeutige Hinweise auf die Bedeutung des Immunsystems für Pathogenese und Verlauf von Autoimmunerkrankungen wurden erhalten, die derzeit zur Entwicklung von neuen therapeutischen Ansätzen führen; künftige Fortschritte in der Entwicklung und Herstellung von wirksamen Vaccinen werden jedoch wesentlich von dem besseren Verständnis der strukturellen Grundlagen des Immunsystems abhängen. Die Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit, Genauigkeit der Massenbestimmung, schnellen Analysenzeiten und Anwendbarkeit zur Analyse komplexer Gemische als Hochleistungsmethode für Strukturaufklärung von Proteinen und Charakterisierung von Protein-Interaktionen erwiesen.<br />Ein zentrales Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Bildung und Ablagerung von Aggregaten des ß-Amyloid (Aß) im Gehirn. Die beiden ersten Abschnitte der vorliegenden Dissertation behandeln die Aufklärung der vollständigen Primärstukturen sowie Identifizierung der N-Glykosilierung von Aß-spezifischen Antikörpern. Plaque-spezifische Antikörper erkennen ein N-terminales Aß-Epitop. Mittels HPLC-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) konnte die vollständige Struktur eines Plaque-spezifischen monoklonalen Maus-Antikörpers aufgeklärt werden. Nahezu vollständige Sequenzbestimungen wurden mittels Datenbank-Suchverfahren sowie De novo - Sequenzierung für die schweren und leichten Ketten erhalten, insbesondere die vollständige Aufklärung von 5 der 6 CDR-Sequenzen des Antikörpers. Die Glycosilierung im Fc-Teil des Antikörpers wurde als Komplexstruktur-Typ mit bis zu 4 terminalen Galactosylresten und einem geringen Anteil an N-Glycolyl-Neuraminsäure identifiziert.<br />Physiologische humane Aß-Antikörper ( Plaque-protektive Antikörper) wurden im Plasma von gesunden Personen identifiziert, die ein Epitop im C-terminalen Bereich (Aß-(21-37)) erkennen und die Bildung von Aß-Aggregaten inhibieren. Die vollständige Primärstruktur und Glykosilierung eines Plaque-protektiven monoklonalen Antikörpers der Maus gegen ein Aß(17-24) Epitop wurde mittels LC-MS/MS, in Kombination mit Stoss-induzierter Dissoziation (CID) und Elektronentransfer- Dissoziation (ETD) aufgeklärt. Die Strukturen aller 6 CDR-Domänen sowie eine bisher unbekannte Konsensus-Sequenz der Glycosilierung in den leichten Ketten konnten bestimmt werden. Die Glycosilierungsstruktur enthält teilweise hybridisierte Glycane der Mehrantennenstruktur mit einem High-mannose -Typ und einem Komplex-Typ, und terminalen N-Acetyl- und N-Glycolyl-Neuraminyl-Gruppen.<br />Weitere Strukturuntersuchungen wurden von humanen, Plaque-protektiven Aß-Autoantikörpern aus Immunglobulinpräparaten nach Affinitätsisolierung mit immobilisiertem Aß(12-40) durchgeführt. Durch Bestimmung der Primärstrukturen konnten alle 4 IgG-Subklassen auf der Ebene der entsprechenden Glycopeptide bestimmt werden. Die Subklassen-spezifische Glykosilierung ergab relativ erhöhte Anteile an IgG2/IgG3 sowie IgG4. Die Bestimmung der Glykanstruktur der einzelnen IgG-Subklassen ergab ähnliche Glycosilierungen mit leicht erhöhtem Agalactosylanteil.<br />ß-Amyloid wird durch proteolytische Prozessierung des Transmembran-Amyloid-Vorläuferproteins APP gebildet, dessen genaue Struktur und Funktionen bisher nicht bekannt ist. In Strukturuntersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten 3 spezifische O-Glycosilierungen an den Threoninresten T291, T292 und T576 mittels LC-MS/MS in Kombination mit ETD- und CID- Fragmentierung aufgeklärt werden. Die O-Glycosilierungen wurden als kurze Core-1 Typ- Glycane mit N-Acetylgalactosamin und terminalen Silinsäureresten, sowie linearen (T291, T292) und verzweigten Strukturen (T576) identifiziert.<br />Im letzten Abschnitt der Arbeit wurde die Subklassen-spezifische Glycosilierung von Plasma-Immunglobulin bei Patienten mit Myositose, im Rahmen einer klinisch-diagnostischen Studie zur Ermittlung von Risikofaktoren bei Patienten mit systemisch-rheumatischen Erkrankungen untersucht. Plasma IgG wurde von Patienten, gesunden Zwillingen sowie Kontrollgruppen gleichen Alters mittels Protein G-Affinitätschromatographie isoliert. Die Analyse der Glycosilierungsstruktur ergab statistisch signikante Erhöhungen von fucosylierten Agalactosyl-Glycoformen bei Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuten auf eine genetische Prädisposition für die Entwicklung von Autoimmun-Erkrankungen, möglicherweise aufgrund von Umweleinflüssen. deposit-license Structure Determination of Autoimmune Disease - Related Proteins by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry 2011-03-24T18:13:48Z 2011-03-24T18:13:48Z Strukturaufklärung der mit Autoimmunerkrankungen assoziierten Proteine mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie - Massenspektrometrie

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Diss_Perdivara.pdf 68

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