Fluoreszenzmikroskopische Lebendzell-Untersuchungen der dynamischen Wechselwirkung von Polyethylenimin-basierten Gentransferpartikeln mit dem Cytoskelett und dem endocytotischen Vesikelsystem

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Endocytose und der intrazelluläre Transport von Nanopartikeln bestehend aus Polyethylenimin (PEI) und DNS, sogenannten Polyplexen, in lebenden Zellen unter überwiegend mechanistischen Gesichtspunkten erforscht. Dabei wurden Techniken der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Verfolgung fluoreszenzmarkierter Nanopartikel und zur beugungsbegrenzten Abbildung von Zellstrukturen, die mittels fluoreszierender Proteine markiert wurden, kombiniert. Ein einzelmolekülsensitiver Mikroskopieaufbau mit beugungslimitierter Auflösung und Laseranregung bei drei Wellenlängen wurde hierzu geplant und erstellt. Die Methode der Einzelpartikelverfolgung liefert quantitative Daten über die Bewegung der Nanopartikel und über deren Umgebung. Durch die Kombination dieser Bewegungsdaten mit der simultan ermittelten Morphologie der zellulären Strukturen, mit denen die Nanopartikel wechselwirken, ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, die Kenntnisse über die Ursachen der Polyplexbewegungen in allen Phasen der Transfektion, unter anderem während der Endocytose, zu erweitern.<br />Die stark heterogene Struktur einer Zelle bedingt einen raschen Wechsel der Bewegungsmodi eines internalisierten Nanopartikels. Für die Analyse dieser Bewegung ist deshalb die objektive, weitgehend automatisierte Segmentierung der heterogenen Trajektorie in Abschnitte mit jeweils gleicher Bewegungsform erforderlich. Hierzu wurde im Zuge dieser Arbeit ein neuartiger Algorithmus entwickelt, der ohne vorhandenes Wissen über die zugrundeliegenden Bewegungsformen Abschnitte mit ähnlicher Schrittlängen- und Schrittwinkelverteilung detektiert. Bei der Analyse dieser homogenen Trajektorienabschnitte kamen drei Methoden zum Einsatz: die "klassische" Analyse mittels der mittleren Verschiebungsquadrate, deren Verallgemeinerung auf das Spektrum weiterer Momente der Verschiebungen und ein neues Verfahren, das im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, basierend auf einer globalen Analyse der Trajektorienform mittels der Fourier-Beschreibung einer Kurvenparametrisierung.<br />Die Experimente wurden überwiegend an Huh7-Zell-Linien durchgeführt, die stabil Fusionsproteine aus dem fluoreszierenden Protein EGFP und einem weiteren Protein exprimierten, wodurch der Zellkern oder Strukturen des Cytoskeletts sowie des endosomalen Systems im Fluoreszenzmikroskop detektierbar wurden. Dadurch konnte in allen Phasen der Transfektion die Wechselwirkung der Polyplexe mit den entsprechenden Strukturen beobachtet und analysiert werden.