Gerichtete Evolution und Charakterisierung einer thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz für geschädigte DNA

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Datum
2008
Autor:innen
Glöckner, Christian
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Directed evolution and characterization of a thermostable DNA polymerase towards increased acceptance of damaged DNA
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
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Erschienen in
Zusammenfassung

DNA-Polymerasen katalysieren die gesamte in der Natur vorkommende DNA-Synthese und sind die Schlüsselenzyme in zellulären Prozessen wie Replikation, Rekombination und Reparatur von DNA-Schäden. Gerade der letztere Prozess ist begleitet von einer Vielzahl verschiedener DNA-Polymerasen mit unterschiedlichsten Aufgaben während der Reparatur und erst kürzlich sind neue spezialisierte Enzyme entdeckt worden, die eine Rolle beim Überlesen von DNA-Schäden spielen und zum größten Teil unter dem Begriff der Y-Familie-Polymerasen zusammengefasst werden. Die DNA kann eine Vielzahl von DNA-Schäden erleiden, wie z.B. Hydrolyse des Phosphodiester-Rückgrates, Schädigung der Nukleobasen, Angriff durch Sauerstoffradikale, Schädigung durch UV-Licht, etc.. Diese Schäden stellen eine signifikante Barriere für replikative DNA-Polymerasen dar, können jedoch von der Zelle durch Rekrutierung spezialisierter DNA-Polymerasen repariert bzw. überlesen werden. Bis heute ist noch nicht genau geklärt, wie Zellen im Detail über solche Schäden hinweg DNA-Synthese betreiben können. Um weitere Einblicke in diese Mechanismen zu erlangen sollte ausgehend von einer DNA-Polymerase, die nicht über DNA-Schäden hinweglesen kann ein Enzym durch gerichtete Evolution entwickelt werden, dass diese Eigenschaft erfüllte. Zu diesem Zweck wurde eine N-terminal verkürzte Variante der Taq DNA-Polymerase ausgewählt (Klentaq (KTQ)), die eine große Rolle in biotechnologischen Anwendungen spielt und ein gut charakterisiertes Enzym darstellte.
Durch gerichtete Evolution und Durchmusterung einer randomisierten DNA-Polymerasen-Bibliothek konnte eine Variante gefunden werden, die über DNA-Schäden hinweg lesen konnte und diese auch in einer PCR-basierten Reaktion amplifizieren konnte. Diese Variante wies nur eine einzige Aminosäure-Substitution auf. Methionin (M) 747 war zu Lysin (K) mutiert, was den Austausch einer hydrophoben zu einer kationischen Aminosäure bedeutete in räumlicher Nähe zum DNA-Templat-Strang. Diese Variante (KTQ M747K) wurde biochemisch im Vergleich zum Wildtyp Enzym charakterisiert.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezielt die Position 747 der Klentaq DNA-Polymerase randomisiert und erneut auf einen DNA-Schaden Bypass hin untersucht. Dabei wurde gefunden, dass sich kationische Aminosäure-Substitutionen wie Lysin oder Arginin (R) positiv auf die Schaden-Bypass Eigenschaft auswirkten, anionische Aminosäure-Substitutionen wie Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D), diese verhinderten und im Allgemeinen zu einer verringerten Funktion der DNA-Polymerase führten. Da sich diese zwei Aminosäuregruppen in ihrer Ladung (kationisch anionisch) unterscheiden und in direkter Nähe zum anionisch geladenen DNA-Substrat befanden, wurde vermutet, dass die erhaltenen Effekte durch elektrostatische Wechselwirkungen bedingt waren. Diese Vermutung wurde in weiteren Experimenten bestätigt.
Im dritten Teil der Dissertation wurden die Varianten KTQ M747K und KTQ M747R mit einer bereits literaturbeschriebenen Variante der Taq DNA-Polymerase (Taq I614K) kombiniert. Es standen neben dem Wildtyp-Enzym die folgenden Varianten zur Vefügung: KTQ M747K, KTQ M747R, KTQ I614K, KTQ I614K+M747K (DM (KK)) und KTQ I614K+M747R (DM (KR)). Diese Varianten wurden biochemisch charakterisiert und zwei Varianten wurden in einer Kooperation mit dem Lehrstuhl für Biophysik und Strukturbiologie, Universität Konstanz durch M. Sc. Andreas Schnur im Rahmen seiner Dissertation kristallisiert. Die bisher unveröffentlichten Strukturen der KTQ M747K und KTQ DM (KK) im Komplex mit dem DNA-Substrat, zusammen mit dem Vergleich bereits bestehender Kristallstrukturen einer Y-Familie DNA-Polymerase (Dpo4) gaben neue Hinweise auf die Mechanismen, die das Überlesen von DNA-Schäden durch DNA-Polymerasen ermöglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass neben den bisher bekannten sterischen Besonderheiten der Y-Familie DNA-Polymerasen des Weiteren intensive elektrostatische Interaktionen mit dem DNA-Substrat von großer Bedeutung für das Überlesen von DNA Schäden sind.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

DNA polymerases catalyze all of nature s DNA synthesis and are key enzymes in cellular processes as replication, recombination and repair. The latter process is accompanied by many different DNA polymerases with different functions during the repair process and only recently a novel family of DNA polymerases was being identified and classified as the Y-family of DNA polymerases. DNA can suffer from many different DNA damages as e.g. hydrolysis of the phosphodiester backbone, damage of the nucleobases, attack by oxygen radicals, UV-light induced damages, etc..Those lesions represent a significant barrier for replicative DNA polymerases but are repaired by recruting specialised DNA polymerases that repair or bypass the respective DNA lesion. Untill today it is not yet fully understood how cells can synthesize DNA across those DNA lesions. To gain furhter insights into the mechanistic aspects of this process a DNA polymerase should be evolved by directed evolution that can bypass DNA lesions starting from an enzyme originally lacking this function. A N-terminal shortend version of the Taq DNA polymerase (Klentaq (KTQ)) was chosen, which plays an important role in biotechnological applications and represented a well characterized enzyme.
By directed evolution and screening of a randomized DNA polymerase library one variant could be found that could bypass DNA lesions and amplify damaged DNA in a PCR based amplification.This variant showed only a single amino acid substitution. Methionine (M) 747 was mutated towards lysine (K), which meant the exchange of a hydrophobic towards a cationic amino acid in close proximity to the DNA substrate. This variant (KTQ M747K) was biochemicaly charcterized and compared to the wildtype enzyme.
In the second part of this work amino acid position 747 of Klentaq polymerase was randomized and screened again for an improved DNA lesion bypass. It was found that cationic amino acid substitutions such as lysine or arginine (R) showed a positive effect on DNA lesion bypass, whereas anionic substitutions such as glutamic acid (E) or aspartic acid (D) decreased the lesion bypass ability and lead to a loss of DNA polymerase function. Since these two classes of amino acids differ in their charge (cationic anionic) and were found in close proximity to the anionic DNA substrate it was assumed that the observed effects were due to elctrostatic interactions. This assumption could be confirmed by further experiments.
In the third part of this dissertation the variants KTQ M747K and KTQ M747R were combined with a literature cited variant of the Taq DNA Polymerase (Taq I614K). Besides the wildtype enzyme the following variants were applied for furhter experiments: KTQ M747K, KTQ M747R, KTQ I614K, KTQ I614K+M747K (DM (KK)) und KTQ I614K+M747R (DM (KR)). These variants were biochemicaly characterized and two variants were crystallized in a cooperation with Lehrstuhl für Biophysik und Strukturbiologie, University Konstanz by M. Sc. Andreas Schnur during his dissertation. The still unpublished structures of KTQ M747K and KTQ DM (KK) in complex with the DNA substrate were compared to published structures of a Y-family DNA polymerase (Dpo4) and lead to new insights of the mechanistic aspects for DNA lesion bypass by DNA polymerases. It could be shown that besides the known steric features of Y-family DNA polymerases further apsects of intense electrostatic interactions between DNA polymerases and the DNA substrate are of great importance for bypassing DNA lesions.

Fachgebiet (DDC)
500 Naturwissenschaften
Schlagwörter
Klentaq DNA-Polymerase, geschädigte DNA, Klentaq DNA polymerase, damaged DNA, directed evolution, polymerase chain reaction
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690GLÖCKNER, Christian, 2008. Gerichtete Evolution und Charakterisierung einer thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz für geschädigte DNA [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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June 20, 2008
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