Confocal microscopy on fluorescently labelled single DNA molecules and force-extension measurements on DNA carpets

Lehner, Roman

Confocal microscopy on fluorescently labelled single DNA molecules and force-extension measurements on DNA carpets

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dissertation_Roman_Lehner.pdf(6.62 MB)

Date

2005

Authors

Lehner, Roman

Title in another language

Konfokale Mikroskopie an fluoreszent markierten DNA Molekülen und Kraft-Ausdehnungs-Messungen an DNA Teppichen

Publication type

Dissertation

Abstract

Ziel dieser Arbeit ist es chemische, molekularbiologische und physikalische Methoden zu entwickeln die es erlauben ein Ensemble von DNA Molekülen in definierter Weise zu strecken. Dies soll strukturanalytische Untersuchungen des B-S Übergangs von DNA erlauben, was zur Aufklärung der Wechselwirkung von DNA mit dem RecA protein beitragen könnte. RecA ist ein Protein, das für die Rekombination in E.coli verantwortlich ist. Um Kraft-Dehnungskurven an einem Ensemble von DNA Molekülen zu messen wurde eine neuartige Kraftapparatur entwickelt und charakterisiert. In dieser Apparatur werden die DNA Moleküle chemisch zwischen zwei Substraten gebunden. Dies wird durch funktionalisieren der DNA Enden mit spezifischen Ankermolekülen, wie z.B. Biotin, Digoxigenin oder Thiol, erreicht. \newline Als erstes wurde die Effizients der Funktionalisierung von DNA mit den Ankermolekülen bestimmt. Es wurde gezeigt, dass mindestens 70% der DNA Moleküle mit Biotin oder Digoxigenin markiert sind. Für mit Biotin markierte DNA Moleküle konnte eine maximale DNA Moleküldichte von 0.14 1/mikron^2 auf Streptavidin funktionalisierten Oberflächen nachgewiesen werden. Für mit Thiol markierte DNA Moleküle konnte die gleiche maximale Moleküldichte auf Goldoberflächen gefunden werden. Die beobachtete Bindungskinetik von mit Biotin markierten DNA Molekülen legt ein durch Diffusion kontrolliertes Bindungsmodell nahe. Weiterführende Experimente werden vorgeschlagen. Da einzelne DNA Moleküle mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz Mikroskopie aufgelöst werden können, ist es möglich Einzelmolekülexperimente durchzuführen. Dazu wurde lambda-DNA mit YOYO-1 fluoreszent gefärbt. Die Konturlänge der gefärbten DNA wurde bestimmt, indem DNA Moleküle in einem elektrischen Feld gestreckt wurden. Der gemessene Wert von 19.8 mikrometer stimmt mit Literaturwerten sehr gut überein. Außerdem wurden statische und dynamische Eigenschaften der gestreckten DNA Moleküle gemessen. Diese Messungen könnten zum Verständnis des Einflusses hydrodynamischer Wechselwirkungen auf die Polymerkonfiguration eines elektrokinetisch gestreckten Polymers beitragen. Unter Ausnützung der longitudinalen Auflösung der konfokalen Mikroskopie wurden zum ersten Mal 3-dimensionale Monomerdichte-Profile von DNA Molekülen verschiedener Länge gemessen. Es wurde eine exzellente Übereinstimmung mit theoretischen Voraussagen gefunden. Des Weiteren wurden die Endsegmente der DNA Moleküle mit fluoreszent gefärbten Kolloiden markiert. Dies ermöglichte es, die Verteilungsfunktion der Endsegmente zu messen. Diese Resultate sind die ersten experimentellen Tests theoretischer Vorhersagen für die Konformation von end-angehefteten Polymeren im "Mushroom" Regime.

Summary in another language

The goal of the present work was to develop chemical, molecular biological and physical methods for stretching an ensemble of DNA molecules in a defined way, in order to perform structural analysis of the B-S transition of DNA which may shed light on the interaction of DNA with the RecA protein, responsible for recombination in E.coli. For force-extension measurements on an ensemble of DNA molecules we have constructed a new force apparatus, whose development and characterization is presented. Inside this device functionalized DNA has to be chemically grafted between to substrates for force-extension experiments. First the efficiency of functionalizing DNA with specific adhesion molecules such as biotin, digoxigenin and thiol for end-grafting DNA onto a substrate is determined. We show that at least about 70 % of a DNA assay can be labelled with biotin or digoxigenin. The grafting of DNA onto different functionalized surfaces was verified by fluorescence microscopy. For end-grafting DNA specifically onto a streptavidin-coated glass surface via the biotin linker we found a maximal DNA density of at least about 0.14 micrometer^2 . The same maximal density is achieved for coupling DNA onto a gold surface with the thiol linker. However in case of digoxigenin maximal grafting density is reduced as much as a factor of 10 whith respect to biotin-streptavidin grafting. Based on the binding kinetics of biotin-labelled DNA molecules we also suggest a diffusion-controlled binding model and propose future studies on the influence of tether-length on ligand-receptor binding kinetics. The characterization of the DNA carpet by confocal fluorescence microscopy suggested to perform optical single-molecule experiments. The contour length of YOYO-1 stained lambda-DNA at a dye:basepair ratio of 1:5 was measured to be 19.8 micrometers by stretching the DNA in an electric field and applying the WLC-model. The value is consistent with values available in literature. By measuring static and and dynamic properties of DNA molecules stretched by an electric field we have shown how one could investigate the influence of hydrodynamic interactions in the case of electro-kinetic stretching of DNA molecules. Using the longitudinal resolution capabilities of confocal microscopy we measured for the first time 3-dimensional monomer density profiles of end-grafted DNA molecules of different length and found an excellent agreement with theoretical predictions. Using fluorescently stained colloids we labelled the end segment of individual DNA molecules and were able to measure the distribution function of the end-segment of end-grafted DNA molecules. Our results provide the first direct experimental test of theoretical predictions for the conformation of end-attached polymers in the mushroom regime.

Subject (DDC)

530 Physics

Keywords

DNS,Konfokale Mikroskopie,Polymere,Biophysik,DNA,Confocal microscopy,single molecules,mushroom,Biophysics

Cite This

ISO 690

LEHNER, Roman, 2005. Confocal microscopy on fluorescently labelled single DNA molecules and force-extension measurements on DNA carpets [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

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Examination date of dissertation

March 15, 2005