Isolierung des Proteinkinasegenes snf1 aus Colletotrichum graminicola und ihre Bedeutung für die Pathogenese
Isolierung des Proteinkinasegenes snf1 aus Colletotrichum graminicola und ihre Bedeutung für die Pathogenese
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2004
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Wernitz, Marcus
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Isolation of the protein kinase gen snf1 from Colletotrichum graminicola and its impotance for pathogenicity
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Dissertation
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Abstract
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war festzustellen, welche Bedeutung den CWDE bei der Penetration der Maisepidermiszellen während der von Colletotrichum graminicola zu Teil wird. Dieser phytopathogene Ascomycet generiert in melanisierten Appresso-rien Druck zur Unterstützung der Penetration durch die pflanzliche Zellwand in die Epidermiszellen seines Wirtes. Die Kraft die dabei von der Penetrationshyphe auf die Unterlage ausgeübt wird wurde mit 17,5µN bestimmt. Pilze ohne Appressorien sind alleine auf CWDE angewiesen, da sie keinen Druck generieren können. Eine unbe-antwortete Frage war daher die Bedeutung der CWDE für die Pathogenese von
C. graminicola, der Druck zur Penetration nutzt.
Experimente in anderen phytopathogenen Pilzen zeigten, mit sehr wenigen Ausnah-men, keine Effekte, wenn einzelne oder mehrere CWDE (bis zu 4 gleichzeitig) durch Deletionsmutationen ausgeschaltet wurden. Der Grund dafür findet sich in der Re-dundanz der CWDE. Wird ein Gen ausgeschaltet, findet man eine ähnliche Enzym-aktivität, die von einem anderen Protein vermittelt wird. Daher wurde vermutet, das es einen universalen Regulator für diese Enzyme gibt, wie er in Saccharomyces mit SNF1 beschrieben wurde. Diese Proteinkinase reguliert die Derepression von durch Glukose reprimierte Enzyme, die für die Erschießung alternativer Kohlenstoffquellen verantwortlich zeigen.
Durch die Verwendung degenerierter Primer, die von hoch konservierten Bereichen homologer SNF1-Genen abgeleitet wurden, war es möglich, ein Fragment zu amplifi-zieren, das sukzessive bis auf 2204 bp verlängert wurde. Darin befand sich ein 1743 bp langes offenes Leseraster mit 2 Introns, das insgesamt für ein 580 Aminosäure langes Protein kodierte. 1212 bp der klonierten Sequenz wurden für die Konstruktion eines Knockout-Vektors verwendet, indem eine Hygromycin-Resistenz-Kassette in den translatierten Bereich eingebaut wurde. Nach der Transformation des Wildtyp-Isolates mit diesem Konstrukt wurden 2 Transformanten identifiziert, in denen das Wildtypgen für SNF1 durch eine homologe Rekombination ausgeschaltet worden war und zusätzlich eine Transformante mit einer ektopischen Integration des Deletions-vektors.
Bei den durchgeführten Pathogenitätstests zeigte sich, daß die Pathogenese der De-letionsmutanten verzögert und ihre Virulenz verringert war. Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigten sich im Vergleich zur Entwicklung des Wildtypisolates morpho-logische Unterschiede: Die Bildung der Appressorien war deutlich vermindert und es konnten keine longitudinal wachsenden Sekundärhyphen beobachtet werden. Da-durch ergab sich eine typische Morphologie der Infektionsstrukturen, die als Infekti-onsstern beschrieben wurde.
Enzymatische Untersuchungen der Kulturüberstande der Mutanten, deren einzige Kohlenstoffquelle isolierte Maiszellwände waren, zeigten eine Reduktion der enzy-matischen Aktivitäten von Cellulasen, Xylanasen und Pektinasen.
Zytorrhyzieversuche ergaben keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Deletions-mutante, woraus gefolgert wurde, daß es durch die Mutation zu keiner Veränderung der Zusammensetzung der appressorialen Wand gekommen ist.
Die Knockout-Mutante wuchs deutlich langsamer auf verschiedenen Kohlenstoffquel-len, wobei es sich sowohl um komplexe Verbindungen wie isolierte Maiszellwände, aber auch monomere Verbindungen handelte.
Durch die Verwendung von Agardiffusionstests von Kulturüberständen konnte eine Repression durch Glukose gegenüber cellulolytischen, aber nicht den pektischen Enzymen im Wildtyp demonstriert werden.
C. graminicola, der Druck zur Penetration nutzt.
Experimente in anderen phytopathogenen Pilzen zeigten, mit sehr wenigen Ausnah-men, keine Effekte, wenn einzelne oder mehrere CWDE (bis zu 4 gleichzeitig) durch Deletionsmutationen ausgeschaltet wurden. Der Grund dafür findet sich in der Re-dundanz der CWDE. Wird ein Gen ausgeschaltet, findet man eine ähnliche Enzym-aktivität, die von einem anderen Protein vermittelt wird. Daher wurde vermutet, das es einen universalen Regulator für diese Enzyme gibt, wie er in Saccharomyces mit SNF1 beschrieben wurde. Diese Proteinkinase reguliert die Derepression von durch Glukose reprimierte Enzyme, die für die Erschießung alternativer Kohlenstoffquellen verantwortlich zeigen.
Durch die Verwendung degenerierter Primer, die von hoch konservierten Bereichen homologer SNF1-Genen abgeleitet wurden, war es möglich, ein Fragment zu amplifi-zieren, das sukzessive bis auf 2204 bp verlängert wurde. Darin befand sich ein 1743 bp langes offenes Leseraster mit 2 Introns, das insgesamt für ein 580 Aminosäure langes Protein kodierte. 1212 bp der klonierten Sequenz wurden für die Konstruktion eines Knockout-Vektors verwendet, indem eine Hygromycin-Resistenz-Kassette in den translatierten Bereich eingebaut wurde. Nach der Transformation des Wildtyp-Isolates mit diesem Konstrukt wurden 2 Transformanten identifiziert, in denen das Wildtypgen für SNF1 durch eine homologe Rekombination ausgeschaltet worden war und zusätzlich eine Transformante mit einer ektopischen Integration des Deletions-vektors.
Bei den durchgeführten Pathogenitätstests zeigte sich, daß die Pathogenese der De-letionsmutanten verzögert und ihre Virulenz verringert war. Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigten sich im Vergleich zur Entwicklung des Wildtypisolates morpho-logische Unterschiede: Die Bildung der Appressorien war deutlich vermindert und es konnten keine longitudinal wachsenden Sekundärhyphen beobachtet werden. Da-durch ergab sich eine typische Morphologie der Infektionsstrukturen, die als Infekti-onsstern beschrieben wurde.
Enzymatische Untersuchungen der Kulturüberstande der Mutanten, deren einzige Kohlenstoffquelle isolierte Maiszellwände waren, zeigten eine Reduktion der enzy-matischen Aktivitäten von Cellulasen, Xylanasen und Pektinasen.
Zytorrhyzieversuche ergaben keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Deletions-mutante, woraus gefolgert wurde, daß es durch die Mutation zu keiner Veränderung der Zusammensetzung der appressorialen Wand gekommen ist.
Die Knockout-Mutante wuchs deutlich langsamer auf verschiedenen Kohlenstoffquel-len, wobei es sich sowohl um komplexe Verbindungen wie isolierte Maiszellwände, aber auch monomere Verbindungen handelte.
Durch die Verwendung von Agardiffusionstests von Kulturüberständen konnte eine Repression durch Glukose gegenüber cellulolytischen, aber nicht den pektischen Enzymen im Wildtyp demonstriert werden.
Summary in another language
The aim of this work was to study the importance of cell-wall degrading enzymes (CWDE) for the pathogenesis of Colletotrichum graminicola. This phytopathogenic ascomycete uses melanized appressoria to generate turgor to support the initial penetration of the maize epidermis cells. The force of the penetration peg supplied to the underground was measured with 17.5 µN. As other fungi without appressoria are not capable of generating pressure they have to use CWDE for penetration. An un-answered question was the importance of these enzymes for the penetration process itself and the following pathogenesis.
As experiments in other pythopathogenic fungi showed, with very few exceptions, there were almost no results by knocking out single or multiple CWDE (up to 4 simultaneously). This was due to redundancy of CWDE. If one gene is deleted, there are still others, expressing enzymes with similar activities. Therefore a regulator for CWDE was postulated and SNF1 was found to have a very similar function in yeast. It regulates the derepression of alternative carbon sources exploring enzymes, which are repressed by glucose.
By using degenerated primers derived from conserved regions of already described homologues of SNF1 it was possible to get a sequence from C. graminicola. This was elongated up to 2204 bp, including an ORF of 1743 bp and 2 introns, coding for 580 amino acids. 1212 bp of the cloned sequence were used to assemble a knock-out-construct by insertion of a hygromycin-resistence cassette into the coding region of snf1 and by transformation of the wildtype fungus replacing the wildtype gene with this construct. 3 deletion mutants and 2 ectopic-integrated isolates were identified and used for further studies.
Pathogenicity tests showed a delayed and reduced infection process that was further analyzed. Microscopic data revealed a reduced appressoria formation of the knock-out mutant and the absence of longitudinal growing secondary hyphae, resulting in characteristic infection morphology, called an infection star .
Enzymatic experiments showed a reduction of enzymatic activities in culture filtrates of mutant isolates, grown in isolated maize cell walls, with respect to cellu-lases, xylanases and pectate lyase.
Cytorrhyzie experiments revealed no differences between wildtype and knockout iso-lates, concluding no change of the appressorial wall composition.
Knockout mutants grew clearly slower on different carbon sources, including complex polymeres contained in the corn cell wall, but also monomeric carbon sources. Using agar diffusion tests repression by glucose of cellulytic, but not pectic enzymes was shown for the wildtype.
As experiments in other pythopathogenic fungi showed, with very few exceptions, there were almost no results by knocking out single or multiple CWDE (up to 4 simultaneously). This was due to redundancy of CWDE. If one gene is deleted, there are still others, expressing enzymes with similar activities. Therefore a regulator for CWDE was postulated and SNF1 was found to have a very similar function in yeast. It regulates the derepression of alternative carbon sources exploring enzymes, which are repressed by glucose.
By using degenerated primers derived from conserved regions of already described homologues of SNF1 it was possible to get a sequence from C. graminicola. This was elongated up to 2204 bp, including an ORF of 1743 bp and 2 introns, coding for 580 amino acids. 1212 bp of the cloned sequence were used to assemble a knock-out-construct by insertion of a hygromycin-resistence cassette into the coding region of snf1 and by transformation of the wildtype fungus replacing the wildtype gene with this construct. 3 deletion mutants and 2 ectopic-integrated isolates were identified and used for further studies.
Pathogenicity tests showed a delayed and reduced infection process that was further analyzed. Microscopic data revealed a reduced appressoria formation of the knock-out mutant and the absence of longitudinal growing secondary hyphae, resulting in characteristic infection morphology, called an infection star .
Enzymatic experiments showed a reduction of enzymatic activities in culture filtrates of mutant isolates, grown in isolated maize cell walls, with respect to cellu-lases, xylanases and pectate lyase.
Cytorrhyzie experiments revealed no differences between wildtype and knockout iso-lates, concluding no change of the appressorial wall composition.
Knockout mutants grew clearly slower on different carbon sources, including complex polymeres contained in the corn cell wall, but also monomeric carbon sources. Using agar diffusion tests repression by glucose of cellulytic, but not pectic enzymes was shown for the wildtype.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
Colletotrichum graminicola snf1 pathogenität,Colletotrichum graminicola snf1 pathogenicity
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ISO 690
WERNITZ, Marcus, 2004. Isolierung des Proteinkinasegenes snf1 aus Colletotrichum graminicola und ihre Bedeutung für die Pathogenese [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Examination date of dissertation
January 23, 2004