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Untersuchung der anaeroben Spaltung von Ethern am Beispiel des 2-Phenoxyethanol-Abbaus durch Acetobacterium Stamm LuPhet 1

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Prüfsumme: MD5:dad47785f0c0ac42e89d971f70084785

MÜLLER, Britta, 2006. Untersuchung der anaeroben Spaltung von Ethern am Beispiel des 2-Phenoxyethanol-Abbaus durch Acetobacterium Stamm LuPhet 1

@phdthesis{Muller2006Unter-8803, title={Untersuchung der anaeroben Spaltung von Ethern am Beispiel des 2-Phenoxyethanol-Abbaus durch Acetobacterium Stamm LuPhet 1}, year={2006}, author={Müller, Britta}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Müller, Britta 2011-03-24T17:46:34Z Studies on the anaerobic cleavage of ethers on the example of the 2-phenoxyethanol-degradation by Acetobacterium strain LuPhet 1 application/pdf deu Untersuchung der anaeroben Spaltung von Ethern am Beispiel des 2-Phenoxyethanol-Abbaus durch Acetobacterium Stamm LuPhet 1 deposit-license 2006 Substanzen, die Etherfunktionen enthalten, sind in der Umwelt weit verbreitet, dazu zählen Ether aus natürlichen Quellen, wie Methylether, Glycerolipide und das Polymer Lignin, oder xenobiotische Chemikalien wie Polyethylenglycole, diverse Detergentien und viele Agrochemikalien. Erfahrungsgemäß werden Etherverbindungen in der Natur relativ schlecht abgebaut (White et al., 1996). Unter oxischen Bedingungen erfolgt eine Ether-Spaltung gewöhnlich durch Oxygenasen, die eines der Kohlenstoffatome der Etherbrücke hydroxylieren, sodass dadurch Halbacetale bzw. Halbketale entstehen. Diese instabilen Zwischenstufen zerfallen in wässrigen Lösungen zu Alkohol und Aldehyd bzw. Keton. Enzyme, die Ether unter anoxischen Verhältnissen spalten können, sind dagegen kaum untersucht.<br />Der Organismus Acetobacterium Stamm LuPhet 1 wurde als Vertreter der verschiedenen anaeroben PEG-Verwerter ausgesucht, weil er außerdem den Monoether 2‑Phenoxyethanol spalten kann, zu Phenol und Acetaldehyd. Das entsprechende Enzym wurde als Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase bezeichnet. Des weiteren katalysiert Acetobacterium Stamm LuPhet 1 die Dehydratisierung von vicinalen Diolen wie Ethylenglycol, ebenfalls unter Bildung der Aldehyde (Frings und Schink, 1994).<br />In der vorliegenden Arbeit zeigte sich in Übereinstimmung mit den früheren Arbeiten, dass die Dehydratisierung von vicinalen Diolen wie Ethylenglycol durch ein Coenzym-B12-abhängiges Enzym katalysiert wurde, das den bekannten Coenzym-B12-abhängigen Diol-Dehydratasen (EC 4.2.1.28 bzw. EC 4.2.1.30) ähnlich ist. Bei den Enzymen für Diol-Dehydratisierung bzw. Phenoxyethanol-Spaltung handelte es sich um voneinander unabhängige Enzyme, letzte Zweifel an ihrer Verschiedenheit wurden ausgeräumt. Die Kernfragen der Arbeit lauteten somit: Wie sieht der Mechanismus der Phenoxyethanol-Spaltung von Acetobacterium Stamm LuPhet 1 aus? Wie wird dieses nicht-aktivierte Substrat angegriffen? Von welchen Cofaktoren ist das Enzym abhängig?<br />Alle Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden mit ganzen Zellen oder mit Zellextrakt von Acetobacterium Stamm LuPhet 1 durchgeführt. Die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war bei allen getesteten Kultursubstraten induziert. Die Enzymaktivität der Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war sehr sauerstoffempfindlich. In ehemals oxischen Ansätzen konnte sie durch Zugabe von Reduktionsmittel (Titancitrat) nicht wieder hergestellt werden. Der Zusatz des Reduktionsmittels Titan(III)citrat war wichtig, er sorgte für höhere Aktivität bzw. besseren Erhalt der Aktivität. Dagegen wirkten reduzierenden Schwefelverbindungen (Dithionit, Dithiothreitol bzw. Hydrogensulfid) in millimolaren Konzentrationen (jeweils zusätzlich zu 2,5 mM Titancitrat) schädlich. Für die Phenoxyethanol-Spaltung wurden mit ganzen Zellen Anfangsaktivitäten von ca. 5‑10 U/mg Protein, mit zellfreiem Extrakt oft von ca. 1 U/mg Protein erhalten; letzteres ist deutlich mehr als zuvor für Extrakt berichtet wurde (Frings und Schink, 1994). Die Umsatzrate verringerte sich aber nach der Substratzugabe kontinuierlich, sodass bei zellfreiem Extrakt nach maximal 3,5 min kein weiterer Umsatz mehr stattfand. Bei ganzen Zellen nahm die Aktivität während der ersten ca. 1-3 min ebenfalls ab, danach jedoch wurde die weitere Umsetzung mit einer gleichbleibenden Aktivität, die etwa der in-vivo-Aktivität von 1 U/mg Protein entsprach, fortgesetzt. Daraus wurde gefolgert, dass die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase nach einer bestimmten Zahl von Zyklen aus dem Kreislauf ausscheidet (Inaktivierung), und dass dies bei ganzen Zellen durch eine kontinuierliche Rückführung von inaktivierter Lyase in den Katalysekreislauf (Reaktivierung) aufgefangen wird. Die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war im Cytosol lokalisiert und weder abhängig von Coenzym B12 noch gab es Hinweise auf eine Abhängigkeit von anderen schwach gebundenen Cofaktoren. Im Rahmen einer Kooperation wurden Mechanismus-Untersuchungen mit Hilfe von 2H- und 13C-markierten Phenoxyethanolen durchgeführt. Um die Ergebnisse erklären zu können, die mit den markierten Phenoxyethanolen in Zellsuspensionen erhalten wurden, kommen vor allem radikalische Enzym-Mechanismen in Frage. Es wurden Mechanismen vorgeschlagen, die ähnlich dem Mechanismus der Coenzym-B12-abhängigen Dehydratasen jeweils mit der Abstraktion eines Wasserstoffatoms von C-1 des Substrats beginnen, dabei jedoch nicht über ein 5´-Desoxyadenosylradikal sondern über ein anderes Radikal ablaufen. Die postulierten Reaktionswege beinhalten eine Umlagerung des Substratradikals und nachfolgende Halbacetalbildung (analog den B12-Dehydratasen, wobei allerdings nicht das Hydroxid sondern das Phenoxid wandert) (Weg I) bzw. eine Abspaltung von Phenolat direkt aus dem Substratradikal, ohne vorherige Umlagerung und Halbacetalbildung (Weg II).<br />Das Auftreten von Inaktivieren und Reaktivieren zusammen mit den Befunden mit 2H- und 13C-markiertem Phenoxyethanol und die anderen Ergebnisse wie die Unabhängigkeit von Coenzymen und die Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff bzw. reduzierenden Schwefelverbindungen, passen gut zu einem Mechanismus, der durch ein Proteinradikal (z. B. ein Glycyl- bzw. Thiylradikal) eingeleitet wird. Insgesamt sprechen die verschiedenen Ergebnisse dafür, dass die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase zur Gruppe der Glycylradikalenzyme gehört. Dementsprechend enthält Acetobacterium Stamm LuPhet 1 vermutlich auch ein SAM-abhängiges Aktivierungsenzym zur Aktivierung der Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase. 2011-03-24T17:46:34Z Müller, Britta

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