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Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli

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Prüfsumme: MD5:20b7a5b37893363bd757a3e65c24a336

HAGER, Jutta, 2005. Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Hager2005Funct-8439, title={Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli}, year={2005}, author={Hager, Jutta}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

eng application/pdf Functional analysis of a heat shock inducible methyltransferase from Escherichia coli Hager, Jutta Hager, Jutta Funktionelle Analyse einer hitzeschock-induzierbaren Methyltransferase von Escherichia coli RrmJ wurde in einer umfassenden Studie von Richmond et al. als ein sehr hitzeinduzierbares E. coli Gen endeckt. In vorrausgegangenen Studien von uns und anderen wurde gezeigt, dass RrmJ als 2 -O-Methyltransferase das universell konservierte Nukleotid U2552 im A-loop der 23S rRNA methyliert. Deletion des rrmJ Genes zeigte, dass ein Stamm, der kein RrmJ expremiert, grosse Wachstumsschwierigkeiten und einen signifikanten Ribosomendefekt aufweist. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass die Um2552 Methylierung Einfluss auf die Assemblierung oder Stabilität des Ribosomes hat. Strukturelle Vergleiche von RrmJ mit anderen 2 -O-Methyltransferasen zeigte, dass vorallem VP39, ein bifunktionales Protein in Vaccinia virus, erstaunliche strukturelle Ähnlichkeiten aufwies. Da VP39 in der Vergangenheit sehr eingehend untersucht wurde, war diese strukturelle Ähnlichkeit von grossem Vorteil für die funktionelle Charackterisierung von RrmJ, welche in dieser Arbeit vorgestellt wird.<br />Mit Hilfe einer umfassenden Mutagenese Studie konnte ich das katalytische Zentrum sowie die Substratbindestelle von RrmJ untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das katalytische Zentrum aus der Triade KDK besteht. Dies erlaubte uns, einen SN2 Mechanismus für die Methylierungsreaktion zu postulieren. Die Aminosäuren, die ich als wichtig für die Substratbindung identifizieren konnte, bilden eine positiv geladene Kante, die mit dem Ribose-Rückgrad des RNA Substrates interagieren kann. Modellierungsstudien, durchgeführt in Kollaboration mit Bart Staker, wiesen darauf hin, dass der A-loop aus der eng gepackten 50S Struktur herausklappen muss, um von RrmJ methyliert werden zu können. Modellierungsstudien mit dem A-loop bestätigten ausserdem die zuvor postulierte Substratbindestelle und gaben zu erkennen, dass U2552 sich einem base flipping Mechanismus unterziehen muss, um in das katalytische Zentrum von RrmJ zu passen.<br />Co-Fraktionierungsstudien mit RrmJ bildeten die Grundlage für die wichtige Entdeckung, dass RrmJ als Assemblierungshelferprotein eine Methyltransferase-unabhängige Funktion ausübt. Der N-terminus von RrmJ erwies sich dabei als absolut notwendig für die Bindung von RrmJ an die 50S ribosomale Untereinheit. Ich konnte zeigen, dass die Bindung von RrmJ an die 50S ribosomale Untereinheit die Assemblierung des 70S Ribosomes unterstüzt. Desweiteren zeigte Caroline Kumsta, eine Diplomandin in unserem Labor, dass RrmJ einen Kälte-sensitiven Phänotypen aufweist, der characteristisch für Assemblierungshelferproteine ist. Diese zweite Funktion von RrmJ scheint daher verantwortlich für den Ribosomendefekt in der rrmJ Deletionsmutante zu sein, anstelle der Um2552 Methylierung, wie anfänglich irrtümlicherweise angenommen. Diese Schlussfolgerung wurde unterstüzt von Caroline Kumsta, die zeigen konnte, dass die Abwesenheit von U2552 keinen Ribosomendefekt verursacht.<br />Und schliesslich führte die Analyse der N-terminalen verkürzten RrmJ Mutante zu der Annahme, dass RrmJ ein zweites Methylierungsziel haben könnte, welches nicht die Bindung an die 50S ribosomale Untereinheit verlangt. Da eines der drei RrmJ Homologen in Hefe tRNA anstelle von rRNA methyliert und da in früheren Studien auch schon gezeigt wurde, dass RrmJ tRNA als Methylierungsziel erkennen kann, ist tRNA ein möglicher Kandidat. Desweiteren liess das Ribosomenprofil der rrmJ Deletionsmutante, die unter Hitzestress Bedingungen gewachsen war, darauf schliessen, dass RrmJ unter diesen Bedingungen nicht in die Ribosomenassemblierung invovliert ist. Daher ist es anzunehemn, dass die Methylierung des vermeintlichen zweiten Substrates RrmJ s Hitzestress Funktion sein könnte.<br />Mit der Beobachtung, dass RrmJ als Methyltransferase mit dualer Substratspezifität und als ribosomales Assemblierungshelferprotein unabhängig von der Methyltransferaseaktivität agiert, war es nun möglich, die vielen verschiedene Phänotypen und Effekte zu erklären, die durch die Deletion dieses hoch konservierten Proteins in einem E. coli Stamm verursacht werden. 2011-03-24T17:43:38Z 2005 2011-03-24T17:43:38Z deposit-license

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