Type of Publication: | Dissertation |
URI (citable link): | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-56564 |
Author: | Geiger, Dominik |
Year of publication: | 2006 |
Title in another language: | Studien zum Wirkmechanismus eines Antiödempeptids |
Summary: |
Pulmonary edema is a life-threatening pathological condition caused by excessive extravascular fluid accumulation in the lung tissue. In 11 different animal models the Tip peptide, a cyclic peptide derived from the lectin-like tip domain of the human tumor necrosis factor α (TNF-α), was shown to up-regulate the rate of lung liquid clearance (LLC), contributing to the resolution of pulmonary edema.
One aim of this thesis was to establish an in vitro activity assay that reflects the Tip peptide s anti-pulmonary edema action and is useful for studies on its mechanism of action. For this purpose, the three human lung epithelial cell lines A549, H441 and Calu-3 were characterized with respect to their suitability for in vitro studies on anti-edema drug candidates. The Calu-3 cell line met all requirements for in vitro analysis of transepithelial ion and fluid transports in regard to expression of ion channels and transporters involved in LLC (e.g. the epithelial sodium channel ENaC, the chloride channel CFTR and the Na,K-ATPase), expression of the water channel aquaporin-5, formation of tight and polarized monolayers, and the capability of transepithelial fluid transport (dome formation) within confluent monolayers. Therefore, Calu-3 cells were used to establish two complementary in vitro assays for pulmonary edema resorption: (1) Bioelectrical properties of polarized cell monolayers were studied by using the Transepithelial Electrical Resistance (TEER) technology ( TEER assay ). (2) The ability of Calu-3 cells for spontaneous dome formation within confluent monolayers allowed the quantitative examination of transepithelial fluid transport ( dome assay ). TEER assay experiments proved that the Tip peptide influences transepithelial conductance of Calu-3 cell monolayers in a polarized and dose dependent manner. This activity requires sodium ions in the assay buffer. Dome assay experiments confirmed that dome formation by lung epithelial cells is a sodium dependent process and that it is induced by the Tip peptide. The effect of the Tip peptide in TEER and dome assays was (partly) inhibitable by the oligosaccharide N,N -diacetylchitobiose. However, a lectin-like binding of this sugar by the Tip peptide could not be detected. Further investigations revealed that the action of the Tip peptide on TEER and dome formation of Calu-3 cells was independent of β-adrenergic receptor activation and cAMP up-regulation. Effects onTEER and dome formation may partly be caused by acetate ions in the peptide preparation. Protein interaction studies led to the identification of nine potential receptor proteins for the Tip peptide, one of which is the transmembrane receptor tyrosine kinase ErbB2. Testing of 40 potential anti-pulmonary edema peptides in the TEER and dome assays revealed that (1) the activity of the Tip peptide was maintained with conservative amino acid exchanges within the TPEGAE core motif. (2) circularization of active peptides enhanced their activity. (3) trimerization of the TPEGAE core motif (or variants thereof) with flexible polyglycine linker sequences increased the activity. In conclusion, this thesis reveals that complementary dome assay and TEER assay experiments with Calu-3 cells are valuable in vitro test systems for the screening of anti-pulmonary edema compounds that directly act on the lung epithelium and stimulate active fluid resorption. It supports the hypothesis that the Tip peptide activates LLC by the direct or indirect activation of apical localized sodium channels of pulmonary epithelial cells and suggests that acetate ions and/or ErbB2 signaling may contribute to the Tip peptide s activity. |
Summary in another language: |
Unter einem Lungenödem versteht man die übermäßige Ansammlung von extravaskulärer Flüssigkeit im Lungengewebe. Es wurde in insgesamt 11 Tiermodellen gezeigt, dass das Tip-Peptid,- ein zyklisches Peptid, welches die Lektin-artige Domäne an der Spitze des humanen Tumornekrosefaktors-α imitiert -, eine Aktivität gegen Lungenödeme besitzt.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, einen In-vitro-Aktivitätstest zu etablieren, der die Ödemresorptionsaktivität des Tip-Peptids reflektiert. Dieses Testsystem sollte dazu dienen, Untersuchungen zum Wirkmechanismus des Tip-Peptids durchzuführen. Zu diesem Zweck wurden die drei menschlichen Lungenepithelzelllinien A549, H441 und Calu-3 hinsichtlich ihrer Eignung für In-vitro-Analysen mit antiödematösen Substanzen untersucht. Die Zelllinie Calu-3 entsprach allen Anforderungen für In-vitro- Untersuchungen zu transepithelialen Ionen- und Flüssigkeittransport in bezug auf die Expression von Ionenkanälen und -transportern, die am Prozess der Lungenödemresorption beteiligt sind (z.B. des epithelialen Natriumkanals ENaC, des Chloridkanals CFTR und der Natrium-Kalium-Pumpe (Na,K-ATPase)), sowie bezüglich der Expression des Wasserkanals Aquaporin-5. Des weiteren eignen sich Calu-3 Zellen zur Züchtung dichter, einschichtiger und polarisierter Zellrasen und besitzen die Fähigkeit, Flüssigkeit zu transportieren (Bildung flüssigkeitsgefüllter Zellkuppeln innerhalb eines dichten Zellrasens = Domes ). Demzufolge wurden mit Calu-3 Zellen zwei sich ergänzende In-vitro-Testsysteme aufgebaut, um die antiödematöse Wirkung des Tip-Peptids zu untersuchen: (1) Unter Verwendung des Transepithelialen-Elektrischen-Widerstand-Messsystems ( TEER-Assay ) wurden die bioelektrischen Eigenschften von polarisierten, einschichtigen Calu-3 Zellrasen untersucht. (2) Die Fähigkeit von Calu-3 Zellen innerhalb eines konfluenten Zellrasens spontan Domes auszubilden ermöglichte die quantitative Untersuchung des transepithelialen Flüssigkeitstransports ( Dome-Assay ). TEER-Assay-Experimente belegten, dass das Tip-Peptid die Ionenleitfähigkeit von Calu-3 Zellschichten nur nach apikaler Zugabe in einer dosisabhängigen Weise beeinflusst. Diese Aktivität des Tip-Peptids erfordert Natriumionen im Probenpuffer. Die Ergebnisse von Dome-Assay-Experimenten bestätigten, dass die Dome-Bildung von Lungenepithelzellen ein Natriumionen-abhängiger Prozess ist, und dass das Tip-Peptid diesen Prozess stimuliert. Die Effekte des Tip-Peptids in den TEER- und Dome-Assays waren (teilweise) durch das Oligosaccharid N,N'-Diacetylchitobiose hemmbar. Eine Lektin-artige Interaktion dieses Zuckers mit dem Tip-Peptid konnte jedoch nicht festgestellt werden. Weitere Untersuchungen deckten auf, dass die Wirkungen des Tip-Peptids von Calu-3 Zellen unabhängig von einer Stimulation β-adrenerger Rezeptoren und einer Hochregulation des intrazellulären cAMP-Spiegels sind. Die Effekte des Tip-Peptids auf den transepithelialen Widerstand und die Dome-Bildung könnten teilweise von Acetationen in der Peptidlösung ausgelöst werden. Proteininteraktionsstudien führten zur Identifikation von neun möglichen Rezeptorproteinen des Tip-Peptids, darunter die transmembrane Rezeptortyrosinkinase ErbB2. Die Aktivitätstestung von 40 alternativen antiödematösen Peptiden zeigte, dass (1) die Aktivität des Tip-Peptids beim Austausch von Aminosäuren gegen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften erhalten blieb. (2) die Zirkularisierung von wirksamen Peptiden deren Aktivität erhöhte. (3) die Aneinanderreihung von drei TPEGAE-Motiven (oder Varianten davon) mit flexiblen Polyglycin-Verbindungssequenzen zu einer Aktivitätssteigerung führte. Folglich macht diese Arbeit deutlich, dass sich ergänzende Experimente mit dem Dome-Assay und einem elektrophysiologischen Messsystem wie dem TEER-Assay mit Calu-3 Zellen hilfreich für die In-vitro-Testung von Substanzen sind, die direkt am Lungenepithel einen aktiven Flüssigkeitstransport anregen und somit eine anti-lungenödematöse Wirkung haben. Sie unterstützt die Hypothese, dass das Tip-Peptid durch die direkte oder indirekte Aktivierung von apikal lokalisierten Natriumkanälen von Lungenepithelzellen die Resorption von Flüssigkeit in der Lunge bewirkt und gibt Hinweise, dass Acetationen und/oder die ErbB2 Signalkaskade zum Wirkmechanismus des Tip-Peptids beitragen könnten. |
Examination date (for dissertations): | Nov 27, 2006 |
Dissertation note: | Doctoral dissertation, University of Konstanz |
Subject (DDC): | 570 Biosciences, Biology |
Controlled Keywords (GND): | Lungenödem, Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>, Ionentransport |
Keywords: | Lungenödemresorption, Tip-Peptid, Lungenepithelzellen, TEER-Assay, Dome-Assay, pulmonary edema clearance, Tip peptide, pulmonary epithelial cells, TEER assay, dome assay |
Link to License: | In Copyright |
GEIGER, Dominik, 2006. Studies on the mechanism of action of an anti-edema peptide [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Diss_Geiger.pdf | 3181 |