RTP1p, eine neue Familie amyloid-ähnlicher Proteine

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KEMEN, Ariane Christiane, 2006. RTP1p, eine neue Familie amyloid-ähnlicher Proteine

@phdthesis{Kemen2006RTP1p-8125, title={RTP1p, eine neue Familie amyloid-ähnlicher Proteine}, year={2006}, author={Kemen, Ariane Christiane}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Kemen, Ariane Christiane deposit-license RTP1p, a new protein family with amyloid-like properties Kemen, Ariane Christiane RTP1p, eine neue Familie amyloid-ähnlicher Proteine 2011-03-24T17:40:48Z application/pdf 2006 deu 2011-03-24T17:40:48Z Bei Uf-RTP1p (U. fabae-Rost Transferiertes Protein 1) handelte es sich um das erste von Rostpilzen sekretierte Protein, welches immuncytologisch nicht nur in der extrahaustoriellen Matrix nachgewiesen werden konnte, sondern auch im Cytoplasma der infizierten Pflanzenzelle. Neben Uf-RTP1p wurden in dieser Arbeit RTP1p Vertreter in drei weiteren Leguminosenrosten identifiziert und molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert.<br />Der molekularbiologische Teil der Arbeit umfasst die Identifizierung der genomischen Sequenzen von RTP1 in den Rostpilzen U. fabae, U. striatus und U. appendiculatus sowie der cDNA Sequenz von U. striatus, wobei ein besonderes Augenmerk auf, für diese neue Genfamilie charakteristische Sequenzeigenschaften gelegt wurde. Northern Blot Analysen zeigten, dass Uf-RTP1 ausschließlich in Haustorien exprimiert wird und damit in der biotrophen Phase eine Rolle spielt. Bei der Regulation der Expression auf Translationsebene scheinen zwei, bei Us-RTP1 identifizierte uORF beteiligt zu sein. Da die RTP1p Vertreter zu Datenbankeinträgen keinerlei Homologie aufweisen, handelt es sich um eine neue Proteinfamilie, die eine Zwei Domänen Struktur aufweist. Sie setzen sich aus einem variablen N Terminus, der eine Anpassung an das jeweilige Wirtssystem darstellen könnte und dem konservierten C-Terminus, der die Funktion von RTP1p bestimmt, zusammen.<br />Sechs RTP1p spezifische, aufgereinigte Antikörper sowie heterologes RTP1p aus Pichia pastoris dienten zur biochemischen Charakterisierung in silico identifizierter Motive. Diese Motive wurden mit Blick auf die Funktion von RTP1p in der extrahaustoriellen Matrix, beim Transfer sowie im pflanzlichen Cytoplasma analysiert.<br />Die relativ kleinen Proteine (ca. 25 kDa) werden auf Grund sehr effektiver, N-terminaler Signalsequenzen in die extrahaustorielle Matrix sekretiert. Vor der exocytotischen Frei-setzung erfolgt eine weitere N-terminale Prozessierung. Diese hat für die Faltung von RTP1p eine entscheidende Bedeutung. Glykosylierungsmutanten in P. pastoris legen zudem den Schluss nahe, dass die Glykosylierung an einer, in allen Sequenzen konservierten Glykosylierungsstelle, essentiell für die Sekretion und Stabilität des Proteins ist. RTP1p wird in die Wirtszelle als glykosyliertes Protein internalisiert. Mit den aufgereinigten Seren konnte in vier Pathosystemen der Transfer von RTP1p in die pflanzliche Zelle bewiesen werden. Damit stellen die RTP1p Vertreter die erste Gruppe von Rostpilzproteinen dar, für welche ein Transfer auf subzellulärer Ebene in die pflanzliche Zelle bewiesen wurde. Über eine in silico identifizierte Sphingolipid-Binde-Domäne könnte der Transfer ins pflanzliche Cytoplasma erfolgen.<br />Um Hinweise auf potentielle Interaktionspartner zu erhalten, wurden Far Western Blot Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse lassen auf zwei Interaktionspartner, mit einem MW von 25 bzw. 50 kDa, schließen. Partner des gleichen Molekulargewichts, wurden neben weiteren potentiellen Partnern auch in Immuno-Co-Präzipitationsstudien und Affinitätschromatographieanalysen wieder gefunden. Damit handelt es sich bei RTP1p um ein multifunktionales Protein, dessen Protein-Proteininteraktion auf einem, für alle RTP1p Sequenzen vorhergesagten Phophoserin/Phosphothreonin-Prolin Motiv beruhen könnte, welches Gruppe IV WW Domänen bei den Interaktionpartnern erkennt.<br />Eine über Cross-Linking Experimente nachgewiesene Aggregation des nativen Uf-RTP1p und des heterologen RTP1p kann auf eine in allen RTP1p Homologen konservierte Beta-Aggregationsdomäne zurückgeführt werden. Die RTP1p Aggregation ist, wie für amyloide Proteine beschrieben, konzentrations- und pH-abhängig. In Kooperation mit E. Kemen (2006) konnte gezeigt werden, dass sich die amorphen, heterologen RTP1-Aggregate über ein für Prionproteine beschriebenes Red-Ox-Experiment in filamentöse Strukturen überführen lassen, wie sie für Prion-ähnliche Proteine beschrieben wurden. Mit diesen teilt RTP1p zusätzlich eine hohe Proteinase K Resistenz.<br />Es wurde mit den in dieser Arbeit charakterisierten RTP1p Vertretern zum ersten mal eine Familie pilzlicher Proteine beschrieben, welche in glykosylierter Form in die Pflanzenzelle aufgenommen werden und durch Multimerisierung über eine Aggregationsdomäne filamentöse Strukturen ausbilden, die eine hohe Proteinase K Resistenz aufweisen. Mit diesen Eigenschaften stellt das in hohen Konzentrationen in der Matrix und im Cytoplasma vorkommende RTP1p, vor allem in älteren infizierten Zellen, einen möglichen Schutz des Pilzes vor antimikrobiellen Komponenten, wie Proteinasen, dar. RTP1p könnte damit als Virulenzfaktor die biotrophe Phase verlängern.

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