Dissertation:
Einfluss von Mikro- und Nanostrukturen auf Zellwachstum und -migration

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2003
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Lehnert, Dirk
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Influence of micro- and nanostructures on cell adhesion and migration
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Abstract
Cell adhesion and migration play a fundamental role during development and maintenance of multicellular organisms. Cells and their behavior have to be regulated amongst other things by the extracellular matrix (ECM) to perform their tasks reliably. Any disruption of this regulation leads to malfunctions and abnormal development. In the presented work, the influence of ECM-geometry on adhesive cells was investigated. Structured substrates used in this study consist of a multitude of small, squared structures covered with adhesive ECM-protein which are embedded in an anti-adhesive surface of several mm² in size. The size of these regularly arranged protein-covered islands ( dots ) was varied between 12 µm² and 0.1 µm², the distance between dots from 1 µm to 30 µm. Using different combinations of these geometries, various in vivo ECM-structures like e.g. basal lamina or mesenchyme tissue were imitated and projected into two dimensions.
To produce the microstructured substrates, the technique of microcontact printing (µCP) was used and advanced. The smallest reproducable protein-covered structures are 0.1 µm² in size. The side lengths of these dots are 300 nm and therefore near the physical limits of optical resolution. In the present study, the full potential of microcontact printing could be exploited for the first time.
Three different fibroblast-like cell lines were plated on microstructured subtrates and their behavior during the first hour after plating was analysed. Cells spread over several ECM-dots and form functional cell-matrix-contacts restricted to the positions of dots. In addition, they show a rectangular morphology as well as straight edges, strictly orientating along the underlying dot-pattern. Variation of the patterns allowed presentation of different surface-coverages with ECM-protein and quantitative analysis of geometrical limits of cell adhesion, cell spreading and migration. It turned out, that the number of adherent cells ist positively correlated with the presented amount of protein and that optimal cell adhesion is achieved at 20% surface coverage with ECM-protein. Another positive correlation was found between cell size and ECM-protein surface coverage with a coverage of 15% being necessary for optimal cell spreading. Astonishingly, on the tested subtrate patterns, these effects are correlated to the surface coverage and not to the geometric pattern of the substrate. Since surface coverage is a function of dot sizes and distances, the influence of anti-adhesive distances on cell spreading was investigated. It turned out that all three tested cell lines can bridge distances of 25 µm. Variation of dot sizes showed, that dots of 0.1 µm² are able to induce intracellular signaling. Furthermore, they support cell spreading when distances between dots are smaller than 4 µm. At larger distances, these small dots are removed from the substrate and internalized into the cells. Cells use the complete surface of dots smaller than 3 µm² for contact formation. Dots of 12 µm² are only used partially and especially at the edges of the dots.
These results let to new models of cell-matrix-interactions. Furthermore, using the advanced technique of substrate patterning by microcontact printing, existing hypotheses can be experimentally tested more precisely now. This will result in a better understanding of cellular behavior, wich can contribute e.g. to surface optimisation of medical implants.
Summary in another language
Zelladhäsion und -migration spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung multizellulärer Organismen. Um ihre Aufgaben zuverlässig erfüllen zu können, werden Zellen in ihren Reaktionen u.a. durch die sie umgebende Extrazelluläre Matrix (ECM) gesteuert. Treten dabei Störungen auf, kann dies zu Fehlfunktionen und krankhaften Entwicklungen führen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der ECM-Geometrie auf das Verhalten von Zelltypen untersucht, die in vivo innerhalb einer dreidimensional strukturierten ECM wachsen. Da die Analyse zellulären Verhaltens in dreidimensionalen Strukturen schwer durchführbar ist, wurden zweidimensional strukturierte Substrate hergestellt. Diese bestehen aus einer zellabweisenden Oberfläche von mehreren mm² Größe, in die eine Vielzahl kleiner, quadratischer Strukturen aus ECM-Protein eingebettet sind. Die Fläche der einzelnen, regelmäßig angeordneten Protein-Inseln ( Dots ) wurde zwischen 12 µm² und 0,1 µm², zwischenliegende Abstände zwischen 1 µm und 30 µm variiert. Durch diese Variationen wurden in vivo vorkommende ECM-Organisationen wie z.B. Bindegewebe oder Basallaminae imitiert und auf definierte zweidimensionale Strukturen projiziert.
Zur Herstellung der mikrostrukturierten Substrate wurde die Technik des Microcontact Printing (µCP) eingesetzt und weiterentwickelt. Die kleinsten reproduzierbar erzielten Proteinstrukturen besitzen eine Fläche von 0,1 µm². Mit einer Kantenlänge von 300 nm liegen diese in der Nähe des lichtmikroskopischen Auflösungsvermögens und an der Grenze des technisch möglichen. Erstmals konnte so im Rahmen der vorliegenden Arbeit das Potenzial dieser Methode voll ausgeschöpft werden.
Auf die Substrate wurden drei Fibroblasten-ähnliche Zelltypen ausplattiert und ihr Verhalten während der ersten Stunde quantitativ analysiert. Die Zellen wachsen über mehrere Protein-Dots, bilden über diesen lokal begrenzt funktionelle Zell-Matrix-Kontakte aus und zeigen eine Morphologie mit rechtwinkligen Ecken und geraden Kanten, die sich strikt am ECM-Muster orientiert. Durch Variation der Muster wurden unterschiedliche Bedeckungen des Substrates mit ECM-Protein erreicht und somit die Analyse der geometrischen Grenzen von Zelladhäsion, Zellspreading und Zellmigration ermöglicht. Es zeigte sich, dass die Anzahl adhärierender Zellen positiv mit der präsentierten Proteinmenge korreliert und dass ab einer Proteinbedeckung von 20% eine optimale Zelladhäsion erreicht wird. Ein positiver Zusammenhang besteht ebenfalls zwischen Proteinbedeckung und Zellgröße, wobei mindestens 15% Substratbedeckung für optimales Größenwachstum (Zellspreading) nötig sind. Erstaunlicherweise scheint bei den hier getesteten Mustern eine direkte Korrelation des Zellspreading nur mit der Proteinbedeckung, nicht aber mit deren Geometrie zu bestehen. Da sich die Substratbedeckung aus den Dotflächen und -abständen ergibt, wurde der Einfluss der anti-adhäsiven Distanzen auf das Zellspreading untersucht. Es zeigte sich, dass alle untersuchten Zelltypen Abstände von bis zu 25 µm überbrücken können. Die Variation der Dotfläche ergab, dass ECM-Punkte von 0,1 µm² intrazelluläre Signaltransduktion induzieren und bei Abständen von ≤ 4 µm Zellspreading ermöglichen. Bei größeren Distanzen werden diese Dots jedoch aus dem Substrat gerissen und internalisiert. Protein-Dots einer Größe von bis zu 3 µm² werden über ihre gesamte Fläche von Zellen zur Kontaktbildung genutzt, während 12 µm² große Protein-Dots nur teilweise und hauptsächlich entlang ihrer Kanten eine zelluläre Kontaktbildung aufweisen.
Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung neuer Modelle der Zell-Matrix-Interaktionen. Zusätzlich können bestehende Hypothesen mit dem nun verfügbaren System experimentell genauer überprüft werden. Dadurch wird ein besseres Verständnis zellulären Verhaltens erzielt, das beispielsweise zur Optimierung der Oberflächen medizinischer Implantate beitragen kann.
--- Eine Beilagen-CD mit Video-Zeitrafferaufnahmen befindet sich beim Druckexemplar der Dissertation in den Beständen der Universitätsbibliothek Konstanz.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
mikrostrukturierte Substrate , Zell-Matrix-Kontakte , Fokalkontakte , microcontact printing , patterned substratum , focal adhesion , integrin , cytoskeleton
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ISO 690LEHNERT, Dirk, 2003. Einfluss von Mikro- und Nanostrukturen auf Zellwachstum und -migration [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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