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The role of ubiquitin, heat shock proteins, and inducible proteasome subunits in major histocompatibility class I antigen presentation

The role of ubiquitin, heat shock proteins, and inducible proteasome subunits in major histocompatibility class I antigen presentation

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Prüfsumme: MD5:f02d2e861b0226a28a2f10911f78ab23

BASLER, Michael, 2004. The role of ubiquitin, heat shock proteins, and inducible proteasome subunits in major histocompatibility class I antigen presentation [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Basler2004ubiqu-7929, title={The role of ubiquitin, heat shock proteins, and inducible proteasome subunits in major histocompatibility class I antigen presentation}, year={2004}, author={Basler, Michael}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Mit Hilfe von Peptiden, die auf MHC-Klasse-I Molekülen präsentiert werden, können zytotoxische T-Lymphocyten mit ihrem T-Zellrezeptor Zellen erkennen, die von Pathogenen infiziert oder zu einer Tumorzelle entartet sind. Das Proteasom, eine abundante Protease eukaryontischer Zellen, spielt dabei eine zentrale Rolle. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Analyse verschiedener Parameter des MHC-Klasse-I Weges, wobei die Rolle der drei induzierbaren, proteolytisch aktiven Untereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 im Mittelpunkt stand. Als Werkzeug, um dies zu untersuchen, wurde das gut charakterisierte Lymphozytäre Choriomeningits Virus (LCMV) verwendet. In der Vergangenheit wurden widersprüchliche Resultate erhalten, ob Ubiquitin für die Präsentation von MHC-I-Liganden benötigt wird. Um Klarheit zu schaffen, wurde in dieser Arbeit Ubiquitin und dominant negative Formen von Ubiquitin in einem Tetrazyklin-induzierbaren System exprimiert. Nach der Induktion von Ubiquitin oder mutiertem Ubiquitin wurden keine Veränderungen in der Ubiquitylierung und in der MHC-I Oberflächenexpression festgestellt. Um die Rolle von Hsp90 in der Antigenprozessierung zu analysieren, wurden Zellen mit Geldanamycin, einem Inhibitor für Hsp90, behandelt. Diese zeigten eine dosisabhängige Reduktion in der Präsentation des LCMV-spezifischen Epitopes NP118-126. Andere LCMV-spezifische Peptide waren dagegen nicht betroffen. Verschiedene Experimente zur Spezifizierung der Rolle von Hsp90 in der Prozessierung von NP118-126 schlugen fehl. Es scheint, dass der Effekt von Geldanamycin auf NP118-126 Zell- und Virus-spezifisch ist. Die Untersuchung des Einflusses von Geldanamycin auf die Präsentation von Epitopen, die am N- oder C-terminalen Ende eines stabilen Proteins exprimiert wurden, zeigte, dass Epitope unabhängig von ihrer Position verschlechtert präsentiert werden. Im Hauptteil dieser Doktorarbeit wurde die Funktion der drei induzierbaren Proteasomuntereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 in der Antigenprozessierung LCMV-spezifischer Epitope untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Interferon-γ-behandelte Zellen das LCMV-spezifische Epitop GP33-41 verbessert und das aus dem gleichen Glykoprotein stammende subdominante Epitop GP276-286 verschlechtert präsentieren. In vitro wie auch in vivo Experimente enthüllten, dass die proteasomale Prozessierung von GP276-286 besser durch das konstitutive Proteasom als durch das Immunoproteasom vollzogen werden kann. Zahlreiche Veröffentlichungen zur Unteruchung der Subdominanz von GP276-286 blieben ohne schlüssige Resultate. Die zuvor erwähnte Zerstörung von GP276-286 durch Immunoproteasome könnte der Grund dafür sein.<br />Der Einfluss von MECL-1 in der Antigenprozessierung wurde mit Hilfe von MECL-1 defizienten Mäusen analysiert. Die Infektion dieser Mäuse mit LCMV zeigte eine reduzierte CTL-Antwort gegen zwei verschiedene Epitope, NP205-212 und GP276-286. Die verschlechterte CTL-Antwort gegen GP276-286 in MECL-1-/- Mäusen konnte nicht mit einem Präsentationsdefekt in diesen Mäusen erklärt werden. CD8-positive Zellen in MECL-1-defizienten Milzen waren im Vergleich zu Wildtyp Mäusen um 20% reduziert. CTLs von MECL-1-defizienten Mäusen, welche das variabe Segment Vß10 in ihrem T Zellrezeptor tragen, proliferierten nicht nach einer LCMV-Infektion. Dieser Befund sowie die Tatache, dass MECL-1 in Zellen, welche die negative Selektion im Thymus vermitteln, konstitutiv exprimiert ist, deuten auf ein verändertes T-Zellrepertoire in MECL-1 defizienten Mäusen hin. Somit konnte gezeigt werden, dass MECL-1 eine wichige Komponente des MHC-I Antigenprozessierungsweg ist. Ein weiterer Faktor, der die Immundominanz einzelner Epitope bestimmt, ist die Kinetik der viralen Proteinexpression. Es wurde gezeigt, dass eine geringe LCMV-Dosis zu einer Dominanz von NP-spezifischen CTLs führt, wohingegen GP-spezifische CTLs nach einer hohen Virus-Dosis dominieren. Die Relevanz von Immunoproteasomen wurde mit Hilfe von Cytomegaloviren (MCMV und HCMV), welche in ihrem Genom zahlreiche Proteine kodieren, die dem Virus helfen, dem Immunsystem zu enkommen, untermauert. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass der Einbau von Immunoproteasomuntereinheiten in MCMV- und HCMV-infizierten Fibroblasten stark vermindert ist. Eine Deletion im Gen M27 von MCMV, welches einen Inhibitor für STAT2 kodiert und somit den IFN-γ Rezeptor Signalweg hemmt, hatte zur Folge, dass die Transkription und Proteinexpression der induzierbaren Proteasomeuntereinheiten wieder normal funktionierten. Das ungewöhnlich lange Signalpeptid des LCMV-Glykoproteins (GP) wurde in transfizierten und LCMV-infizierten Zellen untersucht. Dabei wurde gefunden, dass das Signalpeptid von GP langlebig ist und in Viruspartikeln akkumuliert. Diese Besonderheiten weisen darauf hin, dass das Signalpeptid nicht nur den Glykoproteinvorläufer in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums führt, sondern auch eine zusätzliche bis jetzt unbekannte Funktion im Lebenszyklus des LCMV hat. Basler, Michael eng Basler, Michael 2011-03-24T17:38:36Z Die Rolle von Ubiquitin, HSP und induzierbaren Proteasomuntereinheiten in der MHC-I Antigenpräsentierung The role of ubiquitin, heat shock proteins, and inducible proteasome subunits in major histocompatibility class I antigen presentation deposit-license application/pdf 2011-03-24T17:38:36Z 2004

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