Apoptotic Signaling beyond Caspase Activation in Hepatocytes

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Prüfsumme: MD5:17584e43ed11ce2226545d1c0a1dc1b2

WEILAND, Timo, 2007. Apoptotic Signaling beyond Caspase Activation in Hepatocytes

@phdthesis{Weiland2007Apopt-7902, title={Apoptotic Signaling beyond Caspase Activation in Hepatocytes}, year={2007}, author={Weiland, Timo}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Hepatische Apoptosesignalwege ohne Caspase-Aktivierung Weiland, Timo Apoptotic Signaling beyond Caspase Activation in Hepatocytes eng 2007 Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Beteiligung von Caspasen und Serinproteasen an der Apoptose von Leberzellen zu untersuchen, welche zum einen durch Todesrezeptorliganden und zum anderen durch Stimulantien des intrinsischen Weges ausgelöst wurde. Zusätzlich wurden verschiedene pharmakologische Wirkstoffen, welche epigenetische Regulationsmechanismen beeinflussen, auf ihre Fähigkeit hin untersucht, das HepG2-Zellmodell gegenüber Todesrezeptor-stimulierte Apoptose zu sensitiveren.<br />1. Im Gegensatz zu primären murinen Hepatozyten war die Hemmung von Caspasen in primären humanen Hepatozyten und HepG2-Zellen durch zVAD-fmk nicht ausreichend, um einen Schutz gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose zu erwirken.<br />2. HepG2-Zellen, welche durch die Histondeacetylasehemmer Apicidin, CBHA, M344 und VPA sowie durch den Methyltransferasehemmer 5-Azacytidine sensitiviert wurden, gingen trotz Caspasehemmung in die Apoptose, welche nur durch gleichzeitige Gabe der Serinproteasehemmer TPCK, TLCK und AEBSF verhindert werden konnte.<br />3. Die Stimulantien des intrinsischen Signalweges der Apoptose Camptothecin, Staurosporin und UV-Strahlung führten zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivierung von Caspasen, welche zu einem Zelltod mit typisch apoptotischer Morphologie führte. Der Einsatz des Caspasehemmers zVAD-fmk und/oder von Serinproteasehemmern verhinderte weder die Apoptose noch führte er zu einer veränderten Ausprägung.<br />4. Der allgemeine Caspasehemmer zVAD-fmk hemmte sowohl Initiator- als auch Effektorcaspasen. Weiterhin führte der Einsatz von spezifischen Caspasehemmern zu einer vollständigen Aufhebung der DEVD-Spaltung durch Effektorcaspaseaktivität ohne allerdings die Zellen vor CD95L- und Staurosporin-vermittelter Apoptose zu schützen.<br />5. Die Freisetzung des Caspase-unabhängigen agierenden proapoptotischen Moleküls AIF aus dem Mitochondrium wurde durch den PARP-Hemmer 3-Aminobenzamid verhindert ohne allerdings die Zellen vor CD95L- und Staurosporin-vermittelter Apoptose zu schützen. Das Muster der oligonucleosomalen DNA-Spaltung ist unter Einfluss von zVAD nicht verändert, wie es üblicherweise in einen AIF-abhängigen Zelltod der Fall wäre.<br />Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, das primäre humane Hepatozyten und HepG2-Zellen nicht durch eine generelle Caspasehemmung vor Apoptose geschützt werden. Es scheint, dass zumindest in der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose Serinprotease-abhängige Signalwege existieren, welche parallel zu den Caspase-abhängigen Signalwegen agieren.<br />Die gegen Neoplasien wirksame Substanz 5-Azacytidin, welche seit kurzem zur Behandlung myelodysplastischer Syndrome zugelassen wurde, ist ein bahnbrechendes Beispiel für Methyltransferasehemmer. Deren pharmakodynamischen Eigenschaften wurden untersucht, um die sensitivierende Wirkung auf Hepatozyten zu charakterisieren.<br />1. 5-Azacytidin sensitivierte Hepatozyten gegenüber Todesrezeptor-stimulierter Apoptose.<br />2. In HepG2-Zellen sensitivierte 5-Azacytidin zeit- und konzentrationsabhängig selektiv gegenüber CD95L-und TRAIL-vermittelter Caspaseaktivierung und Apoptose, zeigte aber keine Effekte gegenüber TNF-a.<br />3. Die sensitivierende Wirkung beruhte nicht auf der Hemmung von Methyltransferasen, da andere bekannte Methyltransferasehemmer wie z.B. das Analogon 5-Aza-2 -deoxycytidin keine sensitivierenden Eigenschaften aufwiesen.<br />4. In 5-Azacytidin behandelten Zellen wurden die proapoptotischen Proteine p53 und Bax zeit- und konzentrationsabhängig hochreguliert.<br />5. Nach Rezeptor/DISC unabhängiger Aktivierung des extrinsischen Signalweges durch Überexpression der aktiven Caspase-8, war die Effektorcaspaseaktivität in 5-Azacytidin vorbehandelten Zellen gegenüber Kontrollzellen erhöht.<br />6. Die Caspaseaktivierung und zytotoxische Wirkung von p53/Bax-abhängigen intrinsischen Stimulantien war nach Sensitivierung mit 5-Azacytidin erhöht.<br />7. Im Gegensatz dazu war nach künstlicher Aktivierung des intrinsischen Signalweges durch Zugabe von dATP/Cyctochrom C zu einer cytosolischen S-100 Fraktion von 5-Azacytidin vorbehandelten HepG2-Zellen keine Erhöhung der Effektorcaspaseaktivität messbar.<br />Der Entwurf der Studie beinhaltete primäre humane und murine Hepatozyten wie HepG2-Zellen, um akute Wirkungen von 5-Azacytidin auf die Apoptose zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass 5-Azacytidin Hepatozyten gegenüber Todesrezeptorvermittelte- Apoptose sensitiviert. Als Ursache, werden Beweise für eine p53/Bax-abhängigen Mechanismus vorgestellt, welcher, angesiedelt zwischen DISC und Mitochondrium, zu einer verstärkten Empfindlichkeit gegenüber Apoptose führt. Zusammengefasst geben die Ergebnisse eine ursächliche Begründung für die leberschädigenden Nebenwirkungen von 5-Azacytidin, welche in Patienten mit Lebervorerkrankungen beobachtet wurden. deposit-license 2011-03-24T17:38:23Z application/pdf 2011-03-24T17:38:23Z Weiland, Timo

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