Type of Publication: | Diploma thesis |
URI (citable link): | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-26404 |
Author: | Erhardt, Marc |
Year of publication: | 2006 |
Summary: |
Bacteria swim in liquid environment by rotation of an unique nanomachine, the flagellum. For assembly of the flagellum, a flagellar-specific type III secretion apparatus is essential. The conserved integral membrane components FliOPQR of Salmonella enterica serovar Typhimurium were previously proposed to be part of the type III secretion apparatus. It has been previously shown that FliOPQR are essential for export of flagellar substrates. However, virtually nothing is known about the function and localization of the proteins.
The first part of this work reports the growth and purification of the bacteriophage Chi, who only attacks motile bacteria. Furthermore, the virulence of phage Chi in S. typhimurium strains expressing antigenically distinct flagellin variants is examined. Afterwards, the construction of tetracycline resistance cassette insertions, as well as the construction of clean deletions of fliOPQR is described. It is shown in this chapter that fliO, fliP, fliQ and fliR are required for motility and that a clean deletion of each gene can be complemented by introduction of the respective wildtype gene. The next part of this work reports conserved domains and topology predictions of FliOPQR based on a homology search. Afterwards, the topology prediction is confirmed by construction of C-terminal beta-galactosidase and alkaline phosphatase fusion proteins. Non-motile fliO and fliP mutants are examined by DNA sequencing analysis and subsequently motile revertant mutants of the revealed fliO point mutations (V72G and L91R) are isolated and characterized. In addition, a C-terminal YPF (yellow fluorescent protein) fusion to FliO is constructed and the localization of the FliO-YFP fusion construct is analyzed by fluorescence microscopy. It is found that FliO is probably not localized within the flagellar basal body structure, contrary to previous suggestions. The construction of a S. typhimurium strain, chromosomally expressing FliM-CFP (cyan fluorescent protein) as well as FliO-YFP constructs, confirms this finding by the observation that FliM-CFP and FliO-YFP are not colocalized. In the last part of this work the energization of flagellar type III secretion is analyzed. The flagellar type III secretion apparatus transports most proteins necessary for the assembly of the flagellum across the inner membrane in an ATP-dependent manner. This work shows that flagellar type III secretion is also dependent on the proton motive force. Abolishment of both the proton gradient deltapH and the membrane potential deltaPsi; using the ionophore carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), prevented secretion of the anti-Sigma28 factor FlgM. Secretion of FlgM could be restored by growth in medium lacking CCCP. Furthermore, it is shown that the secretion of FlgM is inhibited at pH 5 in the presence of 34 mM acetate, indicating an important role of the proton gradient deltapH and/or the intracellular proton concentration. Addition of the ionophore CCCP resulted in an immediate growth arrest, but not in a significant decrease of cytoplasmic ATP levels, thus demonstrating that both the flagellar type III secretion ATPase FliI and the proton motive force are necessary for the export of flagellar type III secretion substrates. |
Summary in another language: |
Bakterien schwimmen in wässriger Umgebung durch Rotation einer einzigartigen Nanomaschine, dem Flagellum. Für den Aufbau des Flagellums ist ein Flagellum-spezifischer Typ III Sekretionsapparat notwendig. Als Bestandteil dieses Typ III Sekretionssystems von Salmonella enterica serovar Typhimurium, wurden die konservierten Membranproteine FliOPQR vorgeschlagen. Es wurde von anderen Arbeitsgruppen gezeigt, dass die Proteine FliOPQR in der Tat für den Export von Bausteinen des Flagellums notwendig sind. Über die Funktion, Arbeitsweise und zelluläre Lokalisation der Proteine ist aber fast nichts bekannt.
Diese Arbeit beschreibt im ersten Teil die Aufzucht und die Reinigung des Bakteriophagen Chi, welcher nur motile Bakterien befällt. Des Weiteren wird die Virulenz des Phagen Chi bei S. typhimurium Stämmen untersucht, die unterschiedliche Varianten des Flagellin-Proteins exprimieren. Im Nachfolgenden Abschnitt wird einerseits die Konstruktion von FliOPQR Mutanten, die eine Tetrazyklin-Resistenzkassette inseriert haben, und ausserdem die Konstruktion von chromosomalen Deletionsmutanten von FliOPQR, beschrieben. In diesem Abschnitt wird gezeigt, dass jedes der Gene, fliO, fliP, fliQ als auch fliR, für die Motilität von S. typhimurium nötig ist und dass die chromosomalen Deletionsmutanten von den jeweiligen Wildtyp-Genen komplementiert werden können. Im nächsten Teil dieser Arbeit werden konservierte Domänen und Topologie-Vorhersagen der Proteine FliOPQR, basierend auf einer Homologiesuche, besprochen. Anschließend wird die Topologie-Vorhersage durch die Konstruktion C-terminaler Fusionen von beta-Galaktosidase, als auch alkalischer Phosphatase, an FliOPQR bestätigt. Des weiteren wird die DNA-Sequenz von nicht motilen fliO und fliP Mutanten ermittelt. Nachfolgend werden motile Suppressionsmutanten zweier gefundener Punktmutationen von fliO (V72G und L91R) isoliert und charakterisiert. Im darauf folgenden Abschnitt wird die Konstruktion von YFP (gelbes, fluoreszierendes Protein) an den C-Terminus von FliO beschrieben und die zelluläre Lokalisation von FliO-YFP wird mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Es wird gezeigt, dass FliO wahrscheinlich nicht innerhalb des flagellaren Basalkörpers lokalisiert ist. Zur Bestätigung dieses Ergebnisses wird ein S. typhimurium Stamms konstruiert, welcher die Fusionsproteine FliM-CFP (blaues, fluoreszierendes Protein) und FliO-YFP auf chromosomaler Ebene exprimiert. Durch fluoreszenzmirkoskopische Experimente wird in diesem Stamm gezeigt, dass die Fusionsproteine nicht kolokalisiert sind. Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Energetisierung der Sekretion von Proteinen durch den Flagellum-spezifischen Typ III Sekretionsapparat. Das Typ III Sekretionssystem des Flagellums transportiert die meisten Proteine, die für den Aufbau des Flagellums benötigt werden, über die innere Bakterienmembran in einer von der Hydrolyse von ATP abhängigen Art- und Weise. Diese Arbeit zeigt, dass das Typ III Sekretionssystem des Flagellums zusätzlich von dem Protonengradienten deltapH und dem Membranpotential deltaPsi abhängig ist. Sowohl der Protonengradient als auch das Membranpotential wird durch Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) abgebaut, worauf die Sekretion des anti-Sigma28 Faktors FlgM gehemmt wird. Es wird gezeigt, dass die Sekretion von FlgM durch Wachstum in Medium ohne CCCP wiederhergestellt werden kann. Ausserdem wird die Sekretion von FlgM durch Zugabe von 34 mM Acetat bei pH 5 gehemmt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Protonengradienten deltapH und / oder die cytoplasmatische Protonenkonzentration eine herausragende Role bei der Energetisierung der Typ III Sekretion spielt. Die Zugabe von CCCP führte zu einem augenblicklichen Wachstumsarrest, allerdings wurde keine signifikante Abnahme des cytoplasmatischen ATP Spiegels festgestellt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass sowohl die ATPase FliI des Typ III Sekretionssystems des Flagellum als auch der Protonengradient und das Membranpotential, für den Transport von Substraten durch das Typ III Sekretionssystems des bakteriellen Flagellums notwendig sind. |
Subject (DDC): | 570 Biosciences, Biology |
Controlled Keywords (GND): | Geißel <Biologie>, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium |
Keywords: | Flagellum, Type III secretion, Salomella enterica, proton motive force |
Link to License: | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 2.0 Generic |
ERHARDT, Marc, 2006. Genetic Structure and Function Analysis of the Conserved Integral Membrane Components (FliOPQR) of the Flagellar Type III Secretion Apparatus of Salmonella enterica [Master thesis]
@mastersthesis{Erhardt2006Genet-7870, title={Genetic Structure and Function Analysis of the Conserved Integral Membrane Components (FliOPQR) of the Flagellar Type III Secretion Apparatus of Salmonella enterica}, year={2006}, author={Erhardt, Marc} }
Genetic_Structure_and_function_analysis_of_the_conserved_integral_membrane_components.pdf | 224 |