Untersuchungen zur Expression von Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten

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SIMPFENDÖRFER, Robert, 2008. Untersuchungen zur Expression von Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten

@phdthesis{Simpfendorfer2008Unter-7596, title={Untersuchungen zur Expression von Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten}, year={2008}, author={Simpfendörfer, Robert}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Expression of protein tyrosine-phosphatases in lymphocytes Simpfendörfer, Robert deposit-license deu 2011-03-24T17:35:40Z Simpfendörfer, Robert 2008 Untersuchungen zur Expression von Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten application/pdf 2011-03-24T17:35:40Z In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von sog. Non-Rezeptor Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten ("Splenocyten") untersucht. Mit Hilfe von RT-PCR-Strategien wurden DNA-Sequenzen amplifiziert, die u.a. für verschiedene PTP des Schweins codierten. Folgende Enzyme wurden hierbei in Vektoren kloniert: Tc-PTP, PTP1B, PTP1C, PTP1D, PKA. Die PTP1C und PTP1D gehören zur Unterfamilie der SH2-PTPs, die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP-Unterfamilie weisen einen hydrophoben Bereich im CT auf und sind weitgehend Membrangebundene Enzyme, die an das ER gekoppelt bzw. im Zellkern lokalisiert sind.<br />Die Sequenzierung der PTP-Klone ergab eine hohe Identität (~96 % bei PTP1C und ~99 % bei PTP1D) der Aminosäure-Sequenzen der beiden SH2-PTPs des Hausschweins gegenüber den entsprechenden humanen PTP. Die Sequenzen von Tc-PTP von Schwein und Mensch sind zu ca. 92 % identisch, während die Sequenzen der PTP1B etwas geringere Identitäten von ca. 86 % aufweisen. Die Sequenz der PTP1B des Schweins zeigt im Vergleich zur humanen Sequenz eine Deletion von 8 AS in der Prolin-reichen Sequenz des CT, zwischen G376 und A385 der Human-PTP1B. Weiter, in Richtung CT, liegt bei der PTP1B vom Schwein eine weitere Pro-reiche Sequenz vor (ab P392 in der Human-PTP1B), die in der Human-PTP1B nicht vorkommt.<br />Die Expression der PTP1B und Tc-PTP in kultivierten Splenocyten wurde mit Hilfe von RT-PCR analysiert. LPS erzeugte eine deutliche Erhöhung der mRNA für Tc-PTP nach ca. 6 Stunden, was auf eine erhöhte Gen-Expression zurück zu führen sein könnte. Die Tc-PTP zeigt nach kurzer Zeit (1,5 h) eine Konzentrations-abhängige Erhöhung der mRNA unter H2O2-Exposition der Lymphocyten. Verschiedene chemische Behandlungen (Stimulierung mit IL-6, IL-4, IFNg, und N-Acetylcystein; NAC) von kultivierten Splenocyten beeinflussten gegenseitig die Expression der Tc-PTP und PTP1B. Die Ergebnisse zeigen, daß der Redox-Zustand in Splenocyten eine wichtige Rolle bei der Expressionsregulation der PTP1B und Tc-PTP spielen könnte.<br />Die Expression der Phosphatasen PTP1B/Tc-PTP wurde mit Northern-Blots anhand der mRNA aus isolierten T-Splenocyten untersucht. Für Tc-PTP zeigte sich eine deutliche und konzentrationsabhängige Erhöhung der mRNA nach ConA Behandlung, nicht aber für die PTP1B. Salicylsäure (SS) und NAC verringerten die Menge der mRNA der Tc-PTP in T-Splenocyten. Diese Beobachtung weist möglicherweise auf eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-kB bei der Signaltransduktion hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen kontrolliert. SS konnte jedoch die Zunahme der Expression, die durch ConA induziert worden war, nicht verringern, was wiederum ein Indikator dafür sein könnte, dass ConA in T-Zellen nicht auf Signalwege wirkt, die NF-kB aktivieren. Diese Ergebnisse weisen auf eine Vernetzung verschiedener Signalübertragungswege hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen Steuern und sie weisen auch darauf hin, dass die beiden Gene für die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP Unterfamilie getrennt von einander reguliert werden. Die Enzyme dieser Unterfamilie könnten unterschiedliche Rollen bei der Proliferation der Lymphocyten oder Aktivierung von T-Zellen spielen.<br />Änderungen in der Konzentration von Protein Tyrosinphoshatasen wurden in isolierten T-Lymphocyten aus der Milz in Anwesenheit von Ionophoren und Immunsupressoren mit Hilfe von Western-Blotting untersucht. In Milz T-Lymphocyten verursachten Ca2+ Ionophore (nach 20 h Anwesenheit von Ionomycin und A23187) eine Abnahme der Tc-PTP und in geringerem Ausmaß der PTP1B und PTP1D, aber ohne klaren Effekt auf die Menge der PTP1C und der Rezeptor-Tyrosinphosphatase CD45. Die Immunsupressoren Cyclosporin A, FK-506 und Rapamycin induzierten eine Zunahme der Tc-PTP in T-Splenocyten, die durch beide Ionophore gehemmt wurde. Die PTPs CD45 und PTP1C zeigten keine Änderungen der Protein-Konzentration in T-Lymphocyten nach Behandlung mit Immunsupressoren oder Ionophoren. Die Ergebnisse könnten auf einen "cross-talk" verschiedener Signalübertragungswege hinweisen, weil der aktivierende-Effekt von Immunsupressoren auf die Tc-PTP Expression durch Ionophoren gehemmt wurde. Die aktivierende Wirkung von Immunsupressoren auf die Konzentrationen von Tc-PTP in T-Lymphocyten könnte eine weitere Erklärungsmöglichkeit ihrer Wirkung über die festgestellte hemmende Wirkung von Tc-PTP auf die Aktivierung von T-Zellen eröffnen.

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