Detection and removal of surface-bound pyrogenic contaminations

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2006
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Nachweis und Entfernung von oberflächengebundenen, pyrogenen Verunreinigungen
Forschungsvorhaben
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Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

Medizinprodukte, wie z.B. Kontaktlinsen, Endoskope oder Implantate, finden weltweit ständig wachsende Anwendung. Auch wenn sie jedes Jahr Millionen von Menschenleben retten, können doch zahlreiche Schwierigkeiten auftreten. Beginnend z.B. mit einer Blaseninfektion während eines Krankenhausaufenthaltes bis hin zu Implantatabstoßung und Gewebezerstörung ist eine ganze Palette von Komplikationen möglich. Manche dieser Problematiken werden von fieber-induzierenden Substanzen (Pyrogenen) ausgelöst, die erstens nicht von den angewandten Pyrogentests erkannt werden und zweitens durch Routinesterilisation nicht ausreichend entfernt werden. Um dieser Problematik entgegenzutreten, wurden zwei neue Verfahren miteinander kombiniert und optimiert. Die Anwendung des humanen Vollblutmodells, welches die humane Fieberreaktion in vitro (im Reagenzglas) nutzt, als ein sensitives Nachweissystem, das die inflammatorische Kapazität von Oberflächen wiederspiegelt, und das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma als eine effiziente ungefährliche Sterilisationsmethode, wurden miteinander kombiniert.
Es ist uns gelungen, einen Metallblock zu entwickeln, in den verschiedene Materialien als Platten eingelegt werden können, um die humane Vollblutinkubation mit anschließender Zytokinbestimmung (Interleukin-1-beta), inklusive Positiv- und Negativkontrollen, direkt auf der Oberfläche desselben Prüfkörpers durchzuführen.
Der in vitro Pyrogentest für Oberflächen war in der Lage, auf verschiedenen Materialien getrocknete Pyrogenverunreinigungen mit einer Sensitivität von 10 pg/ml im Falle von Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen. Die Verwendung von gefrierkonserviertem Blut wurde untersucht und erzielte sogar eine niedrigere Nachweisgrenze.
Verschiede immun-stimulierende Substanzen wie Lipid A, der LPS-Anker, Lipoteichonsäure (LTA) von zwei verschieden Bakterienstämmen und in zwei verschiedenen Arten präpariert, Peptidoglykan (PGN) von drei verschiedenen Bakterienstämmen (zwei Gram-positive und ein Gram-negativer), Zymosan und Kombinationen von ihnen wurden eingesetzt und alle konnten konzentrationsabhängig nachgewiesen werden.
Auch manuelle Verunreinigungen, die wahrscheinlichste Situation im Herstellungsprozess eines Medizinprodukts, wurden untersucht und erzielten hohe Zytokinsignale. Verschiedene Reinigungs- und Sterilisationsmethoden wie Waschen, Bürsten, Autoklavieren und trockene Hitze wurden eingesetzt, aber keine ausreichende Verringerung der gemessenen Bioaktivität wurde festgestellt.
Die Verwendung des Niederdruck-Mikrowellen-Entladungs-Plasmas ist eine neue Sterilisationsmethode, die eine Abnahme der Bioaktivität von LPS um zwei Zehnerpotenzen erzielt. Auf der Suche nach dem ausschlaggebenden Depyrogenisierungsreagenz und möglichen Nebeneffekten konnten folgende Ergebnisse geschlussfolgert werden: Die beobachtete Abnahme wird verursacht durch ein Plasma-Pyrogen-Zusammenspiel. Erhöhte Temperatur, Mikrowellenstrahlung und Niederdruckbedingungen spielen dabei keine Schlüsselrolle. Weder ultraviolette Strahlung noch geladene Teilchen beeinflussen die Bioaktivitätsabnahme. Unter unseren experimentellen Bedingungen ist das Vorhandensein von atomarem Wasserstoff das depyrogenisierende Wirkprinzip. Der LPS-Inaktivierungsverlauf ist eine nicht-lineare Funktion der Zeit mit mindestens zwei Phasen, die in ihrer Beseitigungseffizienz signifikant unterschiedlich sind.
Zusammenfassung der Vorteile der zwei kombinierten Systeme:

Der Pyrogentest für Oberflächen
ist quantitativ, sensitiv und bietet umfangreiche Anwendungsmöglichkeiten
ist einfach, robust und praktisch
basiert auf der humanen Fieberreaktion
Die Nachweisbarkeit eines breiten Pyrogenspektrums ist garantiert
Keine Tierversuche sind beteiligt

Das Niederdruck-Mikrowellen-Plasma

arbeitet schnell und effizient
Niedrige Temperatur wird verwendet
Preiswert
Ohne giftige Zusätze
Keine Sicherheitsrisiken für Personal oder Umwelt

Das neue Testsystem erlaubt eine immunologische Qualitätskontrolle durch einen einfachen, standardisierten Test während des Herstellungsprozesses und vor der Implantierung, um eine Pyrogenkontamination auszuschließen. Eine adäquate Möglichkeit wird damit geboten, um zu kontrollieren, ob verschiedene Materialien immunologisch inaktiv, ausreichend depyrogenisiert oder gesäubert sind.
Wir stellten fest, daß das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma eine geeignete Methode ist, um immunaktivierende Verunreinigungen sehr schnell und effizient unter preiswerten und Niedrigtemperatur-Bedingungen, ohne mit dem zugrundeliegenden Substrat zu interagieren und ohne Verwendung von giftigen Zusätze zu entfernen.
Daher ist die Basis für eine neue Dimension des Verbraucherschutzes gelegt, auch wenn die schlussendlichen Bedingungen für manche Verbindungen noch optimiert werden müssen.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Medical devices have a steadily increasing impact worldwide and even though they save millions of lives every year, numerous complications can occur. Starting from local infections, e.g. the bladder, while hospitalization up to implant failure and tissue destruction, a whole range of adverse reactions is possible. Some of these complications are due to pyrogenic contaminations, firstly not detected by routine test systems secondly not sufficiently removed by routine sterilization methods. To overcome these problems, two new techniques were combined, established, and optimized. The human whole blood model, which takes advantage of the human fever reaction in vitro, as a sensitive detection system to mirror the inflammatory capacity of surfaces and the low-pressure microwave discharge plasma as an efficient and non-toxic sterilization system were employed.
We were able to develop a device where material sample plates can be inserted and then the human whole blood test with subsequent cytokine measurement (IL-1β) can be performed directly on the surface. Positive and negative controls on the same piece of material can be run in parallel. The in vitro pyrogen test for surfaces was able to detect lipopolysaccharide (LPS) contaminations with a sensitivity starting at 10 pg/ml LPS dried on the surface. The use of cryo-preserved blood was evaluated and yielded an even lower detection limit. Various immune-stimuli like lipid A, the LPS anchor, lipoteichoic acid (LTA) from two different bacterial strains and from two types of preparation, peptidoglycan (PGN) from three different bacterial strains (two Gram-positive and one Gram-negative), zymosan and combinations of them were employed and all could be detected in a concentration-dependent manner. Also manual contamination, the most likely situation in the manufacturing process, was investigated and resulted in high cytokine signals. Different cleaning and sterilization methods, like washing, brushing, autoclaving and dry-heat, were employed and no sufficient decrease of measured pyrogen activity was achieved.
The use of low-pressure microwave discharge plasma as a new sterilization method showed a two orders of magnitude decrease of LPS bioactivity within some minutes. Identifying the crucial depyrogenation agent and possible contributing effects, it could be concluded: the observed decrease is predominately caused by plasma-pyrogen interactions and increased temperature, microwaves radiation or low pressure conditions did not play a major role. Neither UV radiation nor charged particles were responsible for the bioactivity decrease. The formation of atomic hydrogen appears to be the key depyrogenation agent under our experimental conditions. The LPS removal kinetics is a non-linear function of time with at least two phases differing in their removal efficiency.

To summarize the advantages of the two combined systems

The pyrogen test for surfaces
is quantitative, sensitive and has a wide applicability
is simple, robust and practical
is based on the human fever reaction
The detection of a broad pyrogen range is assured
No animal use is involved

The low-pressure discharge microwave plasma

works fast and efficient
under low-temperature conditions
It is little costly
No toxic compounds are required
No danger neither for the working personnel nor the environment was identified.

The new test system allows an immunological quality control by a simple standardized test during fabrication and before implantation to exclude pyrogen contamination. The system offers an adequate possibility to check whether various materials are immunological inert, properly depyrogenated or cleaned. We found that the low-pressure microwave discharge plasma is an appropriate method to remove immune-stimulating components very fast and efficient, under low-temperature and low-cost conditions, without interacting with the underlying substrate and without using toxic compounds.
Therefore, the prospects for a new dimension of consumer safety were developed, even if the final experimental conditions for some compounds have to be optimized.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
In vitro pyrogen test (IPT) für Oberflächen, Immunstimulatorische Komponenten, Lipoteichonsäure, Peptidoglykan, Niederdruck-Mikrowellen-Plasm, In vitro pyrogen test for surfaces, immune-stimulatory components, Zymosan, Peptidoglycan, Low-pressure microwave plasma, LPS, Lipoteichoic acid
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690HASIWA, Nina, 2006. Detection and removal of surface-bound pyrogenic contaminations [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Die Anwendung des humanen Vollblutmodells, welches die humane Fieberreaktion in vitro (im Reagenzglas) nutzt, als ein sensitives Nachweissystem, das die inflammatorische Kapazität von Oberflächen wiederspiegelt, und das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma als eine effiziente ungefährliche Sterilisationsmethode, wurden miteinander kombiniert.&lt;br /&gt;Es ist uns gelungen, einen Metallblock zu entwickeln, in den verschiedene Materialien als Platten eingelegt werden können, um die humane Vollblutinkubation mit anschließender Zytokinbestimmung (Interleukin-1-beta), inklusive Positiv- und Negativkontrollen, direkt auf der Oberfläche desselben Prüfkörpers durchzuführen.&lt;br /&gt;Der in vitro Pyrogentest für Oberflächen war in der Lage, auf verschiedenen Materialien getrocknete Pyrogenverunreinigungen mit einer Sensitivität von 10 pg/ml im Falle von Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen. Die Verwendung von gefrierkonserviertem Blut wurde untersucht und erzielte sogar eine niedrigere Nachweisgrenze.&lt;br /&gt;Verschiede immun-stimulierende Substanzen wie Lipid A, der LPS-Anker, Lipoteichonsäure (LTA) von zwei verschieden Bakterienstämmen und in zwei verschiedenen Arten präpariert, Peptidoglykan (PGN) von drei verschiedenen Bakterienstämmen (zwei Gram-positive und ein Gram-negativer), Zymosan und Kombinationen von ihnen wurden eingesetzt und alle konnten konzentrationsabhängig nachgewiesen werden.&lt;br /&gt;Auch manuelle Verunreinigungen, die wahrscheinlichste Situation im Herstellungsprozess eines Medizinprodukts, wurden untersucht und erzielten hohe Zytokinsignale. Verschiedene Reinigungs- und Sterilisationsmethoden wie Waschen, Bürsten, Autoklavieren und trockene Hitze wurden eingesetzt, aber keine ausreichende Verringerung der gemessenen Bioaktivität wurde festgestellt.&lt;br /&gt;Die Verwendung des Niederdruck-Mikrowellen-Entladungs-Plasmas ist eine neue Sterilisationsmethode, die eine Abnahme der Bioaktivität von LPS um zwei Zehnerpotenzen erzielt. Auf der Suche nach dem ausschlaggebenden Depyrogenisierungsreagenz und möglichen Nebeneffekten konnten folgende Ergebnisse geschlussfolgert werden: Die beobachtete Abnahme wird verursacht durch ein Plasma-Pyrogen-Zusammenspiel. Erhöhte Temperatur, Mikrowellenstrahlung und Niederdruckbedingungen spielen dabei keine Schlüsselrolle. Weder ultraviolette Strahlung noch geladene Teilchen beeinflussen die Bioaktivitätsabnahme. Unter unseren experimentellen Bedingungen ist das Vorhandensein von atomarem Wasserstoff das depyrogenisierende Wirkprinzip. Der LPS-Inaktivierungsverlauf ist eine nicht-lineare Funktion der Zeit mit mindestens zwei Phasen, die in ihrer Beseitigungseffizienz signifikant unterschiedlich sind.&lt;br /&gt;Zusammenfassung der Vorteile der zwei kombinierten Systeme:&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Der Pyrogentest für Oberflächen&lt;br /&gt;ist quantitativ, sensitiv und bietet umfangreiche Anwendungsmöglichkeiten&lt;br /&gt;ist einfach, robust und praktisch&lt;br /&gt;basiert auf der humanen Fieberreaktion&lt;br /&gt;Die Nachweisbarkeit eines breiten Pyrogenspektrums ist garantiert&lt;br /&gt;Keine Tierversuche sind beteiligt&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Das Niederdruck-Mikrowellen-Plasma&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;arbeitet schnell und effizient&lt;br /&gt;Niedrige Temperatur wird verwendet&lt;br /&gt;Preiswert&lt;br /&gt;Ohne giftige Zusätze&lt;br /&gt;Keine Sicherheitsrisiken für Personal oder Umwelt&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;Das neue Testsystem erlaubt eine immunologische Qualitätskontrolle durch einen einfachen, standardisierten Test während des Herstellungsprozesses und vor der Implantierung, um eine Pyrogenkontamination auszuschließen. 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October 26, 2006
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