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Structural and functional studies on two molybdopterin and iron-sulfur containing enzymes : transhydroxylase from pelobacter acidigallici and acetylene hydratase from pelobacter acetylenicus

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SEIFFERT, Grażyna Bernadeta, 2007. Structural and functional studies on two molybdopterin and iron-sulfur containing enzymes : transhydroxylase from pelobacter acidigallici and acetylene hydratase from pelobacter acetylenicus [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz. Konstanz : Hartung-Gorre. ISBN 3-86628-176-5

@phdthesis{Seiffert2007Struc-7462, title={Structural and functional studies on two molybdopterin and iron-sulfur containing enzymes : transhydroxylase from pelobacter acidigallici and acetylene hydratase from pelobacter acetylenicus}, year={2007}, author={Seiffert, Grażyna Bernadeta}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Strukturelle und funktionelle Analyse von zwei Molybdopterin und Eisen-Schwefel enthaltenden Enzymen: Transhydroxylase aus Pelobacter acidigallici und Acetylen Hydratase aus Pelobacter acetylenicus eng Seiffert, Grażyna Bernadeta application/pdf deposit-license 3-86628-176-5 2007 2011-03-24T17:34:37Z Transhydroxylase aus Pelobacter acidigallici-Das strikt anaerobe Bakterium Pelobacter acidigallici vergärt Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure), Pyrogallol (1,2,3-Trihydroxybenzol), Phloroglucin (1,3,5-Tri-hydroxybenzol) oder 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure zu drei Molekülen Acetat (plus CO2) [Brune et al., 1990; Schink et al., 1982]. Ein Schlüsselenzym dieses Abbauweges ist die Pyrogallol-Phloroglucinol Transhydroxylase (TH), welche in Abwesenheit von O2 Pyrogallol zu Phloroglucinol umsetzt in Anwesenheit von 1,2,3,5-tetrahydroxybenzene als Cosubstrat. Ein möglicher Reaktionsmechanismus wurde von Messerschmidt et al., (2004) auf der Grundlage einer hochaufgelösten Röntgenstruktur vorgeschlagen.<br />Die funktionelle Einheit der Transhydroxylase von P. acidigallici ist ein Heterodimer bestehend aus einer großen (100.4 kDa) und einer kleinen Untereinheit (31.3 kDa). Dieses Enzym ist nahe verwandt mit Enzymen aus der Familie der DMSO-Reduktasen. Obwohl die von der TH katalysierte Reaktion formal keine echte Redox-Reaktion ist, enthält das Enzym drei [4Fe-4S] -Zentren und ein Mo(MGD)2 als Redox-Kofaktoren. Die EPR Spektren (Proben eingefroren bei verschiedenen Redoxpotentialen) zeigten einen Satz komplizierter Resonanzen in Abhängigkeit vom eingebauten Molybdän-Isotop, vom pH der Lösung, und von der Anwesenheit von Anionen wie zB. Chlorid. Die EPR Daten der Mo-TH deuteten auf ein Gleichgewicht hin zwischen zwei Mo(V)-Spezies: Mo(V)-OH2 und Mo(V)-OH. Die Aminosäuren Aspartat und Histidin am aktiven Zentrum scheinen essentiell zu sein für die Katalyse. Inkubationsexperimente mit dem Substrat Pyrogallol und dem möglicher Intermediat 2,4,6,3 ,4 ,5 -hexahydroxydiphenylether ergaben eine geringe Abnahme des Mo(V) EPR-Signals. Im Falle reduzierter Mo-TH führen diese beiden Verbindungen zu einer partiellen Oxidation der Metallzentren, was durch EPR Spektroskopie gezeigt wurde. Dagegen wurde unter gleichen Bedingungen mit dem Kosubstrat 1,2,3,5-tetrahydroxybenzol eine Abnahme des Mo(V) EPR-Signals und die Reduktion der [4Fe-4S]-Zentren erreicht. Ein möglicher Elektronen-Transfer-Weg ausgehend von Mo(MGD)2 in der α-Untereinheit via eines Arginin-Restes zum benachbarten [4Fe-4S]-Cluster in der β-Untereinheit wurde vorgeschlagen.<br /><br />Acetylen Hydratase aus Pelobacter acetylenicus-Das strikt anaerobe, mesophile δ-Bakterium Pelobacter acetylenicus wandelt den ungesättigten Kohlenwasserstoff Ethin (Trivialname: Acetylen) zu Acetat und Ethanol um, mit Acetaldehyd als Zwischenprodukt [Abt, 2001; Kisker et al., 1998; Schink, 1985]. Der erste Schritt dieses Gärungsweges ist die Anlagerung von Wasser an die Dreifachbindung von Acetylen, die von der Acetylen Hydratase (AH) katalysiert wird [Rosner et al., 1995].<br />AH aus P. acetylenicus wurde bis zur Homogenität gereinigt. Die funktionelle Einheit ist das Monomer mit einer molekularen Masse der Aminosäurenkette von 81.9 kDa. Sequenz- und Strukturvergleiche ordnen das Enzym der Familie der DMSO-Reduktasen zu. Es enthält ein W(MGD)2-Zentrum und ein [4Fe-4S]-Cluster vom Cubane-Typ. Wolfram kann durch Molybdän ersetzt werden, die entsprechende Mo-AH zeigt eine signifikant geringere Aktivität. ICP/MS, EPR und UV/VIS-Spektroskopie zeigen, dass P. acetylenicus sowohl Wolfram als auch Molybdän in das Aktivzentrum der AH einbauen kann. Die W-AH sticht unter den andere Mitgliedern der DMSO Familie hervor, da sie mit der Hydratisierung von Acetylen zu Acetaldehyd keine Redox-Reaktion katalysiert. Dabei ist zu beachten, dass das Enzym für die Katalyse durch Natriumdithionit oder Ti(III)-Zitrat reduktiv aktiviert werden muss.<br />EPR-spektroskopische Untersuchungen Dithionit-reduzierter W-AH und Mo-AH zeigen die charakteristischen Resonanzen eines [4Fe-4S]-Zentrums, mit gav = 1.966  0.001. Die mit K3[Fe(CN)6] oxidierte W-AH zeigt das EPR Signal eines W(V)-Zentrums, mit gav = 2.02. Im gegensatz dazu zeigt die Mo-AH ( wie isoliert ) Resonanzen eines Mo(V)-Zentrums, mit gav = 1.99.<br />W-AH wurde unter striktem Ausschluß von Luftsauerstoff in seiner aktiven, reduzierten Form kristallisiert. Die Kristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 1.26 Å erarbeitet. Das W(MGD)2-Zentrum bindet neben einem Cystein-Schwefel einen Sauerstoff-Liganden Wasser oder eine Hydroxygruppe der mit dem benachbarten Aspartat 13 wechselwirkt. Aufbauend auf diesen strukturellen und spektroskopischen Ergebnissen wurde ein erster möglicher Reaktionsmechanismus für die Anlagerung von Wasser an die Acetylen-Dreifachbindung unter Ausschluß von Luftsauerstoff formuliert. Acetylen wird in eine hydrophobe Tasche des Enzyms modelliert, direkt über einem Wasssermolekül, welches an das W(MGD)2-Zentrum gebunden ist. Damit das Substrat Zugang zu diesem neuartigen Aktivzentrum erhalten kann, entwickelt das Protein einen speziellen Substratkanal, weit entfernt von der Stelle, an der dieser normalerweise in anderen Molybdän- und Wolfram-haltigen Enzymen der DMSO Reduktase Familie gefunden wird. Structural and functional studies on two molybdopterin and iron-sulfur containing enzymes : transhydroxylase from pelobacter acidigallici and acetylene hydratase from pelobacter acetylenicus Seiffert, Grażyna Bernadeta Konstanz : Hartung-Gorre 2011-03-24T17:34:37Z

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