Das Sekretom von Uromyces fabae

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LINK, Tobias, 2009. Das Sekretom von Uromyces fabae [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

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2011-03-24T17:34:10Z deu Das Sekretom von Uromyces fabae Link, Tobias deposit-license 2009 In der parasitischen Symbiose von biotroph pathogenen Pilzen mit ihren Wirtspflanzen spielen sehr wahrscheinlich Effektoren eine entscheidende Rolle. Es wird vermutet, dass sie der Unterdrückung der pflanzlichen Abwehrreaktionen dienen und mithelfen, den Wirtsstoffwechsel so umzusteuern, dass die Ernährung des Parasiten durch den Wirt gewährleistet ist.<br />Die vorliegende Arbeit beschreibt die Suche nach Effektoren im System Uromyces fabae auf Vicia faba. Effektoren sind bei sekretierten Proteinen besonders häufig. Da am Haustorium der Kontakt zwischen Pilz und Pflanze am engsten ist, ist hier ein Transfer der Effektoren ins pflanzliche Zytoplasma am wahrscheinlichsten.<br />Deshalb wurde mit Hilfe der Hefesignalsequenzfalle das haustorielle Sekretom von U. fabae untersucht. Dabei wurden 62 aus dem Haustorium sekretierte Proteine (Uf-HSPs) identifiziert. Zur Klärung der Stadienspezifität der Proteinsekretion wurde außerdem das Sekretom von in vitro Infektionsstrukturen im Haustorienmutterzellstadium untersucht. Dabei wurden 42 Uf-ISSPs (aus Infektionsstrukturen sekretierte Proteine) gefunden. Vier Proteine gehören sowohl den Uf-HSPs als auch den Uf-ISSPs an. Damit wurden insgesamt 100 sekretierte Proteine von U. fabae gefunden und gleichzeitig eine erhebliche Stadienspezifität der Sekretion beobachtet. Diese Stadienspezifität wurde durch reverse und Standard Northern Blots bestätigt.<br />Datenbankrecherchen mit Hilfe des BLAST Algorithmus, bei denen zu weniger als der Hälfte aller Proteine Sequenzähnlichkeiten gefunden werden konnten, von denen wiederum die meisten innerhalb der Uredinales angetroffen wurden, zeigten eine Spezifität der sekretierten Proteine für die Rostpilze beziehungsweise von vielen sogar für U. fabae. Dies wiederum weist auf eine durch Wettrüsten zwischen Pflanze und Parasit bedingte Koevolution und dadurch beschleunigte Evolution bei den Proteinen hin und ist ein starker Hinweis darauf, dass viele der gefundenen sekretierten Proteine Effektoren sein könnten. 20 Uf-HSPs also etwa ein Drittel des haustoriellen Sekretoms sind kurz oder cysteinreich oder beides, was auf eine Effektorfunktion im Apoplasten hinweist.<br />Mit Hilfe von internetbasierten Algorithmen wurde unter den Uf-HSPs, deren gesamte Sequenz bekannt war, Uf-RTP1 und vier Avirulenzproteinen (Avr) aus Melampsora lini, von denen ein Transfer in die Pflanzenzelle angenommen wird, nach gemeinsamen Sequenzmotiven gesucht. Dabei wurden zwar Motive gefunden, deren Verteilung über den Datensatz auf eine möglicherweise interessante Funktion hinweist, eine funktionelle Zuordnung dieser Motive, zum Beispiel zum Wirtszelltargeting, gelang jedoch nicht. Auch wurde der Datensatz auf die Häufigkeit der Targetingsignale RXLR und RXLXE/Q/D untersucht und festgestellt, dass die Häufigkeit von RXLXE/Q/D etwa der entspricht, die bei Oomyceten für RXLR erwartet werden würde. Das kann als Hinweis auf die Funktionalität gewertet werden. Einige Proteine wurden auch auf schon bekannte ELMs (eukaryotische lineare Motive) untersucht. Dabei wurden vor allem einfache Motive wie Phosphorylierungsstellen gefunden. Auch ein Motiv, das im Zusammenhang mit der Endozytose steht wurde mehrfach entdeckt, es konnte aber kein übermäßig starkes Vorkommen dieser Motive bei den Uf-HSPs festgestellt werden.<br />Ein Yeast Two Hybrid Screen gegen 153 putative Effektortargets aus verschiedenen Pflanzen zeigte eine große Zahl verschiedener Proteine, die an Uf-RTP1 binden. Für Uf-HSP42a wurde ein ähnliches Muster gefunden und daraufhin noch weitere Ähnlichkeiten zwischen den beiden Proteinen festgestellt.<br />Die immunfluoreszenzmikroskopische Lokalisierung einiger Uf-HSPs bestätigte deren Sekretion aus dem Haustorium. Die erhaltenen Lokalisierungen in der extrahaustoriellen Matrix beziehungsweise im pflanzlichen Zellkern können jedoch nicht als sicher gelten.<br />Diese Arbeit lieferte eine große Zahl von Effektorkanditaten, deren Funktion nun aufgeklärt werden kann. Für die zukünftige Auswahl von Kandidaten in den engeren Kreis der weiter zu untersuchenden Proteine sollte jedoch besser nicht mehr vorrangig die Lokalisierung im pflanzlichen Zytoplasma als Kriterium dienen sondern eher Auffälligkeiten beim Vergleich der Sekretome verschiedener Rostarten, das Vorhandensein von pflanzlichen Interaktionspartnern oder Phänotypen bei mit den Effektorkandidaten transformierten Wirts- oder Nichtwirtspflanzen. Link, Tobias 2011-03-24T17:34:10Z application/pdf The secretome of Uromyces fabae

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