Insights into functions and mechanisms of ribosome-associated chaperones from Saccharomyces cerevisiae
Insights into functions and mechanisms of ribosome-associated chaperones from Saccharomyces cerevisiae
Date
2009
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Koplin, Ansgar
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Einblicke in Funktionen und Mechanismen Ribosom-assoziierter Chaperone in Saccharomyces cerevisiae
Publication type
Dissertation
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Abstract
The folding of newly synthesized proteins into their native structures is a fundamental but failure prone process and therefore controlled by a network of molecular chaperones to assist and ensure correct protein folding events. Chaperones that guide the folding of newly synthesized proteins in the cytosol are classified into two groups: chaperones that are recruited to the ribosome are the first interaction partners of newborn proteins. They are assumed to protect nascent polypeptides against harmful conditions and to support initial cotranslational folding steps, while cytosolic chaperones act subsequently on a subset of newly synthesized proteins to mainly promote post-translational folding steps.
Chaperones associating with the ribosome have been found in all kingdoms of life. While the Trigger Factor (TF) is the only known ribosome-associated chaperone in bacteria, two systems exist in yeast and higher eukaryotes. Both systems, the nascent chain-associated complex (NAC) and the yeast tripartite Ssb-system (Ssb/RAC) are unrelated to TF. In contrast to bacterial TF, the functions of ribosome-associated systems in yeast are still barely defined. The Hsp70/40-based Ssb/RAC-system is per definition a canonical chaperone system, however, its precise function and potential substrates are unknown. Moreover, it is unclear whether NAC contributes to the folding network for newly synthesized proteins since that far no function of NAC could be unambiguously assigned.
This work adds to the knowledge about ribosome-associated chaperones in yeast and focuses on the functions and mechanisms of NAC and the Ssb/RAC-system during de novo protein folding. Genetic surveys were combined with biochemical approaches in order to gain insights into the complex cytosolic chaperone network of eukaryotes.
The key-results are summarized below:
The first main contribution of this study is the finding that the Ssb-system functionally cooperates with NAC in co-translational protein folding in vivo. Simultaneous deletions of genes encoding NAC and Ssb caused a severe synthetic sickness of cells grown at 30¡C and the loss of cell viability under protein folding stress conditions. Deprivation of Ssb impaired NAC association with translating ribosomes and provoked aggregation of newly synthesized proteins, which was enhanced by additional deletion of NAC. Further analysis discovered a second function of Ssb/RAC and NAC in regulating the amount of 60S and 40S ribosomal particles suggesting a profound role in the biogenesis of ribosomes. Nac!ssb! cells revealed the formation of ribosomal halfmers and a pronounced deficiency of ribosomal subunits accompanied by strongly reduced amounts of translating ribosomes. These data provide for the first time evidence that the two ribosome-associated systems NAC and Ssb/RAC are functionally interconnected and contribute to two major cellular processes: the folding of newly synthesized proteins and the production of actively translating ribosomes.
The second main contribution of this study is the identification of the genetic and functional interaction of NAC and the Hsp110 Sse1. Sse1 functions as nucleotide exchange factor (NEF) for two types of Hsp70s, the cytosolic Ssa and the ribosome-associated Ssb. This study showed that NAC and Sse1 genetically interact and the simultaneous deletion caused a severe growth impairment at 30¡C, a sensitivity against drugs inducing protein folding stress and a mild induction of the cellular heat shock response. The phenotype could be complemented by expressing NAC or by overexpression of Fes1, the second NEF for Ssa and Ssb-type of Hsp70s. Loss of Sse1 was accompanied by protein aggregation including polyubiquitinated proteins which was enhanced by additional NAC deletion. Mass spectrometry identified 13 potential Sse1 and NAC substrates including the enzyme Glucose-6-phophate-dehydrogenase. These data further support the theory that NAC is a bonafide member of the cytosolic chaperone network.
In summary, the findings of this work have led to a clearer picture of the mechanisms and functional interplay of ribosome-associated chaperones as decisive regulators at the birthplace of new proteins.
Chaperones associating with the ribosome have been found in all kingdoms of life. While the Trigger Factor (TF) is the only known ribosome-associated chaperone in bacteria, two systems exist in yeast and higher eukaryotes. Both systems, the nascent chain-associated complex (NAC) and the yeast tripartite Ssb-system (Ssb/RAC) are unrelated to TF. In contrast to bacterial TF, the functions of ribosome-associated systems in yeast are still barely defined. The Hsp70/40-based Ssb/RAC-system is per definition a canonical chaperone system, however, its precise function and potential substrates are unknown. Moreover, it is unclear whether NAC contributes to the folding network for newly synthesized proteins since that far no function of NAC could be unambiguously assigned.
This work adds to the knowledge about ribosome-associated chaperones in yeast and focuses on the functions and mechanisms of NAC and the Ssb/RAC-system during de novo protein folding. Genetic surveys were combined with biochemical approaches in order to gain insights into the complex cytosolic chaperone network of eukaryotes.
The key-results are summarized below:
The first main contribution of this study is the finding that the Ssb-system functionally cooperates with NAC in co-translational protein folding in vivo. Simultaneous deletions of genes encoding NAC and Ssb caused a severe synthetic sickness of cells grown at 30¡C and the loss of cell viability under protein folding stress conditions. Deprivation of Ssb impaired NAC association with translating ribosomes and provoked aggregation of newly synthesized proteins, which was enhanced by additional deletion of NAC. Further analysis discovered a second function of Ssb/RAC and NAC in regulating the amount of 60S and 40S ribosomal particles suggesting a profound role in the biogenesis of ribosomes. Nac!ssb! cells revealed the formation of ribosomal halfmers and a pronounced deficiency of ribosomal subunits accompanied by strongly reduced amounts of translating ribosomes. These data provide for the first time evidence that the two ribosome-associated systems NAC and Ssb/RAC are functionally interconnected and contribute to two major cellular processes: the folding of newly synthesized proteins and the production of actively translating ribosomes.
The second main contribution of this study is the identification of the genetic and functional interaction of NAC and the Hsp110 Sse1. Sse1 functions as nucleotide exchange factor (NEF) for two types of Hsp70s, the cytosolic Ssa and the ribosome-associated Ssb. This study showed that NAC and Sse1 genetically interact and the simultaneous deletion caused a severe growth impairment at 30¡C, a sensitivity against drugs inducing protein folding stress and a mild induction of the cellular heat shock response. The phenotype could be complemented by expressing NAC or by overexpression of Fes1, the second NEF for Ssa and Ssb-type of Hsp70s. Loss of Sse1 was accompanied by protein aggregation including polyubiquitinated proteins which was enhanced by additional NAC deletion. Mass spectrometry identified 13 potential Sse1 and NAC substrates including the enzyme Glucose-6-phophate-dehydrogenase. These data further support the theory that NAC is a bonafide member of the cytosolic chaperone network.
In summary, the findings of this work have led to a clearer picture of the mechanisms and functional interplay of ribosome-associated chaperones as decisive regulators at the birthplace of new proteins.
Summary in another language
Die Faltung von neu synthetisierten Proteinen in ihre native Struktur ist ein fundamentaler Prozeß in allen Zellen. Dieser Prozeß ist allerdings anfällig für Fehler, und wird daher von einem Netzwerk molekularer Chaperone unterstützt, welche die korrekte Proteinfaltung kontrollieren und unterstützen. Chaperone, die die Faltung neu synthetisierter Proteine im Zytosol assistieren, werden in zwei Gruppen unterteilt: Chaperone, welche an das Ribosom rekrutiert werden, sind die ersten Interaktionspartner neu gebildeter Proteine. Man geht davon aus, daß sie wachsende Polypeptide schützen und co-translationale Faltungsschritte initiieren können. Zytosolische Chaperone hingegen sind an späteren Faltungsprozessen einiger neuer Proteine beteiligt und fördern vor allem post-translationale Faltungsschritte.
Ribosom-assoziierte Chaperone findet man in allen Reichen des Lebens. Der Trigger Factor (TF) ist bis heute das einzige bekannte Ribosom-assoziierte Chaperon in Bakterien. In Hefe hingegen binden zwei Systeme an das Ribosom: der "nascent chain-associated complex" (NAC) und das aus drei Proteinen bestehende Ssb-System (Ssb/RAC). Beide Systeme weisen jedoch keinerlei Ähnlichkeit mit dem TF auf. Im Gegensatz zum TF in Bakterien sind die Funktionen der Ribosom-assoziierten Systeme in Hefe kaum bekannt. Alle Komponenten des Ssb/RAC-Systems sind Hsp70- bzw. Hsp40-Proteine und daher per Definition klassische Chaperone. Allerdings konnten die genaue Funktion oder potentielle Substrate noch nicht beschrieben werden. Unklar ist außerdem, ob NAC an der Faltung von neu synthetisierten Proteinen beteiligt ist, da NAC bisher keine eindeutige Funktion zugesprochen werden konnte. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der Ribosom-assoziierten Chaperone in Hefe bei und legt den Focus dabei auf die Funktionen und Mechanismen von NAC und dem Ssb/RAC-System während der de novo-Proteinfaltung. Um neue Einblicke in die Komplexität des zytosolischen Chaperon-Netzwerks in Eukaryoten zu gewinnen, wurden genetische mit biochemischen Methoden kombiniert.
Die Hauptresultate dieser Arbeit sind im Folgenden zusammengefaßt.
Induktion Als erster zentraler Aspekt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Ssb-System und NAC während der co-translationalen Proteinfaltung in vivo kooperieren. Die gleichzeitige Deletion der NAC und Ssb kodierenden Gene führte in Zellen bei 30¡C zum synthetischen Defekt und hatte eine verminderte Lebensfähigkeit unter Protein-Faltungsstress-Bedingungen zur Folge. In Abwesenheit von Ssb war die Assoziation von NAC an translatierende Ribosomen vermindert und bewirkte die Aggregation von neu-synthetisierten Proteinen. Diese Effekte wurden durch die zusätzliche Deletion von NAC verstärkt. Weitere Experimente haben eine zweite Funktion von Ssb/RAC und NAC bei der Regulation der Konzentration von 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten gezeigt, was auf eine Beteiligung an der Ribosom-Biogenese schließen läßt. In nacΔssbΔ Zellen konnte die Bildung von ribosomalen Halbmeren und eine dramatisch geringere Konzentration an ribosomalen Untereinheiten begleitet von einer reduzierten Anzahl translatierender Ribosomen beobachtet werden. Diese Daten lieferten zum ersten Mal einen Hinweis auf die funktionale Verbindung zwischen den beiden Ribosom-assoziierten Systemen NAC und Ssb/RAC und deren Beteiligung an zwei wichtigen zellulären Prozessen: der Faltung neu synthetisierter Proteine und der Bildung aktiv-translatierender Ribosomen.
Der zweite entscheidende Beitrag dieser Arbeit war die Identifizierung der genetischen und funktionalen Interaktion zwischen NAC und dem Hsp110 Sse1. Sse1 fungiert als Nukleotid-Austausch-Faktor für zwei Arten von Hsp70-Proteinen, dem zytosolischen Ssa und den Ribosom-assoziierten Ssb. In dieser Arbeit wurde die genetische Interaktion zwischen NAC und Sse1 gezeigt. Deren gleichzeitige Deletion führte zu einem Wachstumsdefekt bei 30¡C, einer Sensitivität gegenüber Faltungsstreß-induzierenden Drogen und zur Induktion einer schwachen Hitzeschock Antwort. Dieser Phänotyp konnte durch die Expression von NAC oder der Überexpression von Fes1, dem zweiten Nukleotid-Austausch-Faktor für Ssa und Ssb, komplementiert werden. Der Verlust von Sse1 führte zur Aggregation von poly-ubiquitinierten Proteinen. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Deletion der NAC kodierenden Gene verstärkt. Mit Hilfe von Massenspektrometrie konnten 13 potentielle Sse1 und NAC Substrate, darunter das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, identifiziert werden. Diese Daten bestätigen, daß NAC eine wichtige Komponente im zytosolischen Chaperon-Netzwerk darstellt.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der Mechanismen und der funktionalen Beziehungen von Ribosom-assoziierten Chaperonen als maßgebliche Regulatoren am Geburtsort neuer Proteine geführt haben.
Ribosom-assoziierte Chaperone findet man in allen Reichen des Lebens. Der Trigger Factor (TF) ist bis heute das einzige bekannte Ribosom-assoziierte Chaperon in Bakterien. In Hefe hingegen binden zwei Systeme an das Ribosom: der "nascent chain-associated complex" (NAC) und das aus drei Proteinen bestehende Ssb-System (Ssb/RAC). Beide Systeme weisen jedoch keinerlei Ähnlichkeit mit dem TF auf. Im Gegensatz zum TF in Bakterien sind die Funktionen der Ribosom-assoziierten Systeme in Hefe kaum bekannt. Alle Komponenten des Ssb/RAC-Systems sind Hsp70- bzw. Hsp40-Proteine und daher per Definition klassische Chaperone. Allerdings konnten die genaue Funktion oder potentielle Substrate noch nicht beschrieben werden. Unklar ist außerdem, ob NAC an der Faltung von neu synthetisierten Proteinen beteiligt ist, da NAC bisher keine eindeutige Funktion zugesprochen werden konnte. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der Ribosom-assoziierten Chaperone in Hefe bei und legt den Focus dabei auf die Funktionen und Mechanismen von NAC und dem Ssb/RAC-System während der de novo-Proteinfaltung. Um neue Einblicke in die Komplexität des zytosolischen Chaperon-Netzwerks in Eukaryoten zu gewinnen, wurden genetische mit biochemischen Methoden kombiniert.
Die Hauptresultate dieser Arbeit sind im Folgenden zusammengefaßt.
Induktion Als erster zentraler Aspekt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Ssb-System und NAC während der co-translationalen Proteinfaltung in vivo kooperieren. Die gleichzeitige Deletion der NAC und Ssb kodierenden Gene führte in Zellen bei 30¡C zum synthetischen Defekt und hatte eine verminderte Lebensfähigkeit unter Protein-Faltungsstress-Bedingungen zur Folge. In Abwesenheit von Ssb war die Assoziation von NAC an translatierende Ribosomen vermindert und bewirkte die Aggregation von neu-synthetisierten Proteinen. Diese Effekte wurden durch die zusätzliche Deletion von NAC verstärkt. Weitere Experimente haben eine zweite Funktion von Ssb/RAC und NAC bei der Regulation der Konzentration von 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten gezeigt, was auf eine Beteiligung an der Ribosom-Biogenese schließen läßt. In nacΔssbΔ Zellen konnte die Bildung von ribosomalen Halbmeren und eine dramatisch geringere Konzentration an ribosomalen Untereinheiten begleitet von einer reduzierten Anzahl translatierender Ribosomen beobachtet werden. Diese Daten lieferten zum ersten Mal einen Hinweis auf die funktionale Verbindung zwischen den beiden Ribosom-assoziierten Systemen NAC und Ssb/RAC und deren Beteiligung an zwei wichtigen zellulären Prozessen: der Faltung neu synthetisierter Proteine und der Bildung aktiv-translatierender Ribosomen.
Der zweite entscheidende Beitrag dieser Arbeit war die Identifizierung der genetischen und funktionalen Interaktion zwischen NAC und dem Hsp110 Sse1. Sse1 fungiert als Nukleotid-Austausch-Faktor für zwei Arten von Hsp70-Proteinen, dem zytosolischen Ssa und den Ribosom-assoziierten Ssb. In dieser Arbeit wurde die genetische Interaktion zwischen NAC und Sse1 gezeigt. Deren gleichzeitige Deletion führte zu einem Wachstumsdefekt bei 30¡C, einer Sensitivität gegenüber Faltungsstreß-induzierenden Drogen und zur Induktion einer schwachen Hitzeschock Antwort. Dieser Phänotyp konnte durch die Expression von NAC oder der Überexpression von Fes1, dem zweiten Nukleotid-Austausch-Faktor für Ssa und Ssb, komplementiert werden. Der Verlust von Sse1 führte zur Aggregation von poly-ubiquitinierten Proteinen. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Deletion der NAC kodierenden Gene verstärkt. Mit Hilfe von Massenspektrometrie konnten 13 potentielle Sse1 und NAC Substrate, darunter das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, identifiziert werden. Diese Daten bestätigen, daß NAC eine wichtige Komponente im zytosolischen Chaperon-Netzwerk darstellt.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der Mechanismen und der funktionalen Beziehungen von Ribosom-assoziierten Chaperonen als maßgebliche Regulatoren am Geburtsort neuer Proteine geführt haben.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
Ribosom,Chaperon,ribosome,chaperone
Conference
Review
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Cite This
ISO 690
KOPLIN, Ansgar, 2009. Insights into functions and mechanisms of ribosome-associated chaperones from Saccharomyces cerevisiae [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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Examination date of dissertation
July 30, 2009