Cytologie und Funktion eines amyloidähnlichen Proteins aus Rostpilzen

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KEMEN, Eric, 2006. Cytologie und Funktion eines amyloidähnlichen Proteins aus Rostpilzen [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Kemen2006Cytol-7250, title={Cytologie und Funktion eines amyloidähnlichen Proteins aus Rostpilzen}, year={2006}, author={Kemen, Eric}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

2011-03-24T17:32:58Z Cytological and functional features of an amyloid-like protein from rust fungi Kemen, Eric RTP1, das Gen des Rost transferierten Proteins 1 , kodiert für ein 23-25 kDa großes Protein (RTP1p), welches spezifisch von Rostpilz-Haustorien exprimiert und in die pflanzliche Wirtszelle transferiert wird.<br />In der vorliegenden Arbeit werden Wege des Transfers in die pflanzliche Zelle, Orte der Lokalisation sowie strukturelle und damit verbundene funktionelle Charakteristika des Proteins aufgezeigt.<br />1.) Ultrastrukturelle Analysen der extrahaustoriellen Membran von Uromyces faba auf Vicia faba und U. striatus auf M. sativa ergaben, dass diese spezialisierte Plasmamembran Einstülpungen in das Cytoplasma hinein aufweist, in welchen sowohl Uf-RTP1p als auch Us RTP1p nahe an der Membran akkumulieren. Dass diese Einstülpungen insbesondere dann auftraten, wenn hohe Konzentrationen von RTP1p im Cytoplasma lokalisiert wurden legt den Schluss nahe, dass diesen Strukturen eine bedeutende Rolle beim Transfer zukommt. Weiter unterstützt wurde die Hypothese durch die Beobachtung, dass diese Membranstrukturen stets eine enge Assoziation zu den pflanzlichen Endomembransystemen aufwiesen.<br />2.) Lebend-Zell-Mikroskopie der Differenzierung von U. fabae Haustorien in Parenchymzellen von Vicia faba ermöglichte die Einteilung der Interaktion in drei Stadien: Stadium A umfasst die Penetration der Wirtszelle und die Differenzierung eines frühen Haustoriums. In Stadium B setzt ein Längenwachstum des Haustorienkörpers in der Wirtszelle ein und in Stadium C beginnt das Haustorium Fortsätze mit verzweigtem Wuchs auszubilden. Von Stadium B an wurde der Zellkern in dichter Assoziation zum Haustorium lokalisiert. Insbesondere in Stadium C war neben der dichten Interaktion von Haustorium und Zellkern, eine Akkumulationen von Chloroplasten um das Haustorium zu beobachten. Bei der Analyse der Cyclose zeigte sich, dass von diesem Stadium an eine zunehmende Lähmung auftrat.<br />Immunocytologische Analysen der Entwicklungsstadien ergaben, dass Uf-RTP1p stadienabhängig sekretiert wird. Insbesondere in späten Stadien in denen die Cyclose zum erliegen kam, wurden hohe Konzentrationen von RTP1p sowohl in der extrahaustoriellen Matrix als auch im Cytoplasma lokalisiert.<br />In elektronenmikroskopischen Analysen dieser Kompartimente wurden an den Orten hoher Uf-RTP1p Konzentrationen sowohl in der extrahaustoriellen Matrix als auch im pflanzlichen Cytoplasma filamentartige Strukturen lokalisiert.<br />3.) Um zu klären warum RTP1p trotz seiner geringen Größe und vorhergesagten Löslichkeit nicht frei im Cytoplasma diffundiert und ob RTP1p in der Lähmung der Cyclose am Haustorium involviert sein könnte, wurden in silico Analysen durchgeführt. Diese Analysen ergaben eine beta-Aggregationsdomäne im konservierten C-terminalen Bereich des Proteins. Ein synthetisches henicosa Peptid der beta-Aggregationsdomäne wies eine spontane Aggregation zu filamentösen Strukturen auf. Aggregationsversuche mit heterolog in P. pastoris exprimiertem Uf-RTP1p (PiRTP1p) ergaben, dass das heterolog exprimierte Protein amorphe Aggregate ausbildet welche sich über ein Redox-Experiment in Filamente konvertieren ließen. Durch Anwendung des Farbstoffs Thioflavin T zum Nachweis amyloider Proteinaggregate, wurden sowohl die amyloidähnlichen Eigenschaften von PiRTP1p als auch des synthetischen Peptids durch fluoreszenzspektroskopische Analysen aufgezeigt. CD-Spektroskopische Analysen zusammen mit Strukturvorhersagen des synthetischen Peptids ließen für die Aggregationsdomäne eine beta-Strang-Loop-beta-Strang Struktur erkennen. Vergleiche dieses Strukturmotivs mit weiteren Proteinen ergaben, dass diese Motive nicht nur bei der Aggregation von Proteinen eine Rolle spielen, sondern zudem den retrograden Transfer in Zellen durch Bindung an Glykolipide ermöglichen.<br />RTP1p ist somit das erste Protein eines pathogenen Pilzes, das in den Wirtsorganismus transferiert wird, eine beta-Aggregationsdomäne besitzt und offensichtlich in der Lage ist amyloidähnliche filamentöse Strukturen auszubilden. Aufgrund ihrer beschriebenen Stabilität könnten diese amyloidähnlichen Filamente entscheidende Funktionen in der mechanischen Stabilisierung der Interaktionszone zwischen Pilz und Pflanze aufweisen und den Pilz vor pflanzlicher Abwehr schützen. RTP1p könnte somit für eine Aufrechterhaltung der Biotrophie nötig sein. deu application/pdf Kemen, Eric Cytologie und Funktion eines amyloidähnlichen Proteins aus Rostpilzen deposit-license 2011-03-24T17:32:58Z 2006

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