Towards understanding the role of the ubiquitinligase E6AP in human disease

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MATENTZOGLU, Konstantin, 2009. Towards understanding the role of the ubiquitinligase E6AP in human disease [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Matentzoglu2009Towar-7084, title={Towards understanding the role of the ubiquitinligase E6AP in human disease}, year={2009}, author={Matentzoglu, Konstantin}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Die Ubiquitin Ligase E6AP (E6 assoziiertes Protein) stellt das Gründungsmitglied der Familie der HECT (homolog zum E6AP C-Terminus) Ubiquitin Ligasen dar. Das zugehörige Gen UBE3A befindet sich auf Chromosom 15 in der Region q11-13. Interessanterweise kann die Deregulation der E6AP Aktivität mit zwei völlig unterschiedlichen Krankheitsbildern beim Menschen assoziiert werden. Vermutlich stellt E6AP damit zurzeit das wichtigste Beispiel für die Tatsache dar, dass nicht physiologische Modulation des Ubiquitin Konjugationssystems zur Ausbildung von humanen Krankheitsbildern führen kann. So kann z.B. nicht physiologische Aktivierung von E6AP zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs beitragen, während Inaktivierung von E6AP kausativ zur Entstehung der schweren neurologischen Erkrankung Angelman Syndrom führt. Zusammen genommen bedeutet dies, dass eine genaue Charakterisierung der Signalwege an denen E6AP beteiligt ist, unumgänglich ist, da bis zum heutigen Tag hierzu sehr wenig bekannt ist. Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der E6AP Physiologie geleistet werden.<br />Während der experimentellen Arbeiten zu dieser wurde jedoch klar, dass die gängigen Säugerzellkultursysteme zur Überexpression oder für RNA Interferenz vermittelte Depletion von E6AP nicht hinreichend verwendbar waren. Der Grund hierfür war das unerwartete Ergebnis aus Zellkulturexperimenten, dass die ektopische Modulation von E6AP Proteinleveln hochgradig zytotoxisch war, so dass entweder Totalverlust der jeweiligen Kultur oder unzulängliche Expression von E6AP bzw. ineffizienter "knockdown" von E6AP beobachtet wurde. Aus diesen Gründen wurden neuartige Zellkultursystem entwickelt, bei denen die Überexpression bzw. der "knockdown" stringent an einen selektierbaren Marker gekoppelt wurde, so dass die üblichen Fallstricke umgangen werden konnten. Für die Überexpression konnte dies durch eine Ubiquitin-Fusionsstrategie erreicht werden, bei der die Antibiotikumsresistenz Puromycin N-Acetlytransferase an Ubiquitin, gefolgt von dem zu exprimierenden Protein fusioniert wurde. Hierbei wird die Tatsache ausgenutzt wird, dass Proteine, die an den C-Terminus von Ubiquitin fusioniert wurden, in Eukaryonten effizient durch zelleigene Ubiquitin spezifische Protease gespalten werden. Ergebnisse aus Experimenten, bei denen das beschrieben Konstrukt verwendet wurde, haben gezeigt, dass wie erwartet, jede transfizierte und Puromycin resistente Zelle das zu exprimierende Protein exprimierte. Eine ähnliche Strategie wurde verwendet um ein RNAi-basierte Knockdownsystem zu etablieren, dass die gleichen Eigenschaften zeigt, wie das Ubiquitin-Fusionssystem. Darüber hinaus wurden bei Systemen zu induzierbaren Systemen weiter entwickelt, die im Folgenden für diverse Fragestellungen verwendet wurden. Aus diesen Experimenten lies sich ableiten, dass die Deregulation von E6AP Expression in beide Richtungen zu drastischen zytotoxischen Effekten in Säugerzellen führt, welche sich nur durch Einstellen des normalen Expressionslevels von E6AP revertieren ließen. Darüber hinaus konnte durch Überexpressionsexperimente mit E6AP Mutanten gezeigt werden, dass der beobachtete zytotoxische Effekt von der Liagseaktivität von E6AP abhängt.<br />Die entwickelten Expressionssysteme wurden weiterführend vor allem dazu verwendet, die Einflüsse von E6AP Expression auf das zelluläre Proteom und Ubiquitom zu untersuchen. Ergänzt wurden diese Experimente durch klassische Affinitätsansätze, mit denen nach E6AP Interaktionspartnern gesucht wurde. Daten aus all diesen Experimenten lieferten drei Proteine, deren Funktion möglicherweise von E6AP beinflusst sein kann. Diese waren Herc2, Nesprin-2 und die schwere Kette des nicht-Muskle Myosins IIA (MYH9). Ein weiterführende Charakterisierung der Kandidaten ergab, dass es sich bei dem HECT Protein Herc2 um einen direkten Interaktionspartner von E6AP handelt, während sich keine Effekt durch E6AP auf MYH9 duch Co-Überexpressionsanalysen in Zellen nachweisen ließ und dies obwohl MYH9 in vitro sehr effizient von E6AP ubiquitiniert wurde. Ähnlich verhielt es sich für das 800 kD große Nesprin-2, ein Protein der Kernmembran. Auch hier konnte keine Interaction mit E6AP nachgewiesen werden. Überraschenderweise jedoch, führt die Überexpression einer inaktiven Mutante von E6AP zu einer quantitativen Relokalisierung von Nesprin-2 aus der Kernmembran hinaus ins Zytosol. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in Purkinje Neuronen von AS Mäusen, mit den verwendeten Methoden, kein Nesprin-2 in der Kernmembran detektiert werden kann während die Nesprin-2 Lokalisation in wild typischen Kontrollmäusen nicht verändert war. Außerdem konnte für E6AP, Herc2 und Nesprin-2 in humanen und murinen Embryonen eine überlappende Gewebeexpression gezeigt werden (Nebennierenmark, Testis u. spinale Neuronen). Towards understanding the role of the ubiquitinligase E6AP in human disease Matentzoglu, Konstantin deposit-license Matentzoglu, Konstantin 2011-03-24T17:31:23Z 2011-03-24T17:31:23Z 2009 application/pdf deu

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