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Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts

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Prüfsumme: MD5:9c580b79a9a3a530da27dc9133363081

KOCH, Michael, 2007. Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz. Konstanz : Hartung-Gorre. ISBN 3-86628-183-8

@phdthesis{Koch2007Struc-7006, title={Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts}, year={2007}, author={Koch, Michael}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Konstanz : Hartung-Gorre eng Koch, Michael 2011-03-24T17:30:48Z 2007 deposit-license application/pdf 2011-03-24T17:30:48Z Strukturelle Studien über Signalproteine: Regulierung des EF-Hand-Proteins S100A2 und Aktivierung des Receptor for Advanced Glycation Endproducts 1. S100A2 ist ein Tumorsuppressor und gehört zur Familie der S100 Proteine, welche die größte Untergruppe der Ca(2+)-bindenden EF-Hand Proteine darstellt. Es liegt als Dimer vor und bindet neben Ca(2+) auch Zn(2+) mit hoher Affinität. Bisher gab es keine übereinstimmenden Studien bezüglich Stöchiometrie, Affinität, Geometrie und Lage der Zn(2+) Bindestellen.<br />In der vorliegenden Arbeit wurden S100A2 und verschiedene S100A2 Varianten in Escherichia coli exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Spektroskopische Untersuchungen zeigten zwei verschiedene Zn(2+) Bindestellen mit jeweils tetraedrischer Koordination. Die erste Bindestelle liegt an der Kontaktfläche der beiden Untereinheiten, wohingegen die zweite Bindestelle durch die Zusammenlagerung zweier S100A2 Dimere gebildet wird. Dies führt zur Bildung eines Tetramers. Die apparente Konstante Kd für Zn(2+) beträgt 25 nM.<br />Die Ca(2+) Affinitäten wurden durch intrinsische Tyrosinfluoreszenz bestimmt. Mit Kd Werten von ~245 µM für die erste und ~60 µM für die zweite EF-Hand bewegen sich die Ca(2+) Affinitäten in einem Bereich, der auch für andere Ca(2+) Sensor S100 Proteine beobachtet wurde. Zn(2+) Bindung in der zweiten Bindestelle führt jedoch zu einer deutlichen Abnahme (300-fach) der Ca(2+) Affinität der einen und einer geringeren Abnahme (3-fach) der anderen EF-Hand. Daher wird die Ca(2+) Affinität durch Zn(2+) Bindung negativ reguliert.<br />S100A2 wurde in seiner inaktiven Ca(2+)-freien Form und in seiner aktiven Ca(2+)-gebundenen Form kristallisiert. Die Kristalle beugten bis zu einer Auflösung von 1.6 Å bzw. 1.3 Å. Beide Strukturen zeigen eine für S100 Proteine typische dimere Organisation. Eine Untereinheit besteht aus einer N-terminalen und einer C-terminalen EF-Hand, die durch die sog. Hinge Region verbunden sind. Das Ca(2+) wird pentagonal bipyramidal koordiniert. Durch eine Positionsänderung von Helix III nehmen Helix III und Helix IV eine erheblich unterschiedliche Orientierung im Vergleich zur Ca(2+)-freien Struktur ein. Durch die Bewegung von Helix III öffnet sich eine hydrophobe Einbuchtung zwischen Helix III und Helix IV, die die Bindestelle für Zielproteine wie z. B. p53 darstellt. Diese Bindestelle zeichnet sich im Vergleich zu anderen Ca(2+)-gebundenen S100 Proteinen durch einzigartige Eigenschaften aus: sie weist eine signifikant grössere und tiefere hydrophobe Einbuchtung auf.<br /><br />2. Der Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) ist ein Zelloberflächenrezeptor. Der extrazelluläre Teil des Rezeptors besteht aus drei immunoglobulin-ähnlichen Domänen: einer V-Typ Domäne und zwei C-Typ Domänen. Eine transmembranäre Helix verbindet den extrazellulären Teil mit der kurzen zytosolischen Domäne. Der Rezeptor bindet eine große Anzahl verschiedener Moleküle, wie advanced glycation endproducts (AGEs), beta-Faltblatt Fibrillen und mehrere S100 Proteine. Die Aktivierung von RAGE spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen Krankheiten wie Diabetes, chronischen Entzündungen, Krebs und in der Alzheimer schen Krankheit. Daher wird RAGE als ein potentielles therapeutisches Zielmolekül angesehen.<br />Drei verschiedene Domänen von RAGE (V-Domäne, V-C1-Domänen und C2- Domäne) wurden exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Fluoreszenztitrationen zeigten, dass die V-C1-Domänen notwendig und ausreichend für Ligandenbindung an RAGE sind. Die kinetischen Analysen der Bindung von S100A12 und von ageBSA an die V-C1-Domänen zeigen eine hochaffine Bindung mit schnellen Assoziationsraten, wohingegen die Bindung von Amyloid-beta durch eine langsame Assoziation gekennzeichnet ist. Amyloid-beta dissoziiert allerdings nicht mehr von RAGE, was zu einer irreversiblen Bindung führt.<br />Kristalle der Ligandenbindedomäne von RAGE (V-C1-Domänen) beugten bis zu einer Auflösung von 1.85 Å. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der V-C1-Domänen zeigten, dass große positiv geladene Bereiche die Oberfläche dominieren. Daher zieht das Oberflächenpotential von RAGE negativ geladene Moleküle wie AGEs, S100 Proteine oder Amyloid-beta an.<br />Bisher ist nicht vollständig verstanden wie RAGE aktiviert wird, und wie Signale ins Zellinnere übertragen werden. Es wird vermutet, dass die Signalübertragung durch Rezeptoroligomerisierung vermittelt wird. Ein Aktivierungsmechanismus durch Dimerisierung von RAGE stimmt mit der Anordnung der V-C1-Moleküle im Kristall überein, wo zwei Moleküle seitlich aneinander angeordnet sind. Aufgrund dieser Wechselwirkung von zwei V-C1-Molekülen im Kristall wurden surface plasmon resonance Experimente durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen zwei V-C1-Molekülen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird folgendes Aktivierungsmodell für RAGE vorgeschlagen: Ligandenbindung an RAGE stabilisiert einen dimeren oder höher multimeren Zustand des Rezeptors. Dadurch nähern sich die zytosolischen Domänen einander an, und induzieren die Bildung einer Signalplattform, die die intrazellulären Signalkaskaden aktivieren kann. Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts 3-86628-183-8 Koch, Michael

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