Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase

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Prüfsumme: MD5:881b09a23ddc5f076e802972d33b3f24

PEINELT, Christine, 2004. Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase

@phdthesis{Peinelt2004Kinet-6921, title={Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase}, year={2004}, author={Peinelt, Christine}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

application/pdf deu Die Ionenbindung und Freisetzung an der SR-Ca-ATPase wurde in den beiden Hauptkonformationen E1 und P-E2 mittels des Fluoreszenzfarbstoffs 2BITC untersucht. Apparente Bindungskonstanten wurden aus Titrationsexperimenten bestimmt, die absoluten Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten aus Simulationsmodellen.<br />Die Ergebnisse der Gleichgewichtstitrationen in der E1-Konformation, zeigen die kompetetive Bindung von Ca2+, H+ und Mg2+ an die Bindungsstellen in der Membrandomäne des Proteins. Die apparenten Halbsättigungskonstanten für Ca-Ionen ließen sich in Abwesenheit von Mg-Ionen bei pH 8 zu 34 nM, bei pH 7.2 zu 185 nM und in Anwesenheit von 1 mM Mg2+ und bei pH 7.2 zu 364 nM bestimmen. Der Hill-Koeffizient der Ca2+-Bindung erhöhte sich bei höherer Protonenkonzentration (pH 7.2 gegenüber pH 8) von 1 auf 1.4 und spiegelt eine erhöhte Kooperativität der Bindung wider.<br />Alle durchgeführten Experimente zur Ionenbindung in E1 ließen sich durch das Schema I (Fig. 34) unter Verwendung eines einzigen Parametersatzes simulieren. Schema I enthält keinen Enzymzustand, in dem sowohl ein Proton als auch ein Ca2+ gebunden sind, und wird als lineares Reaktionsschema bezeichnet. Mit Hilfe von Schema I konnten die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten der Ca2+-Bindung zu K1 = 4x10-8 M und K2 = 5x10-8 M, die der Mg2+-Bindung zu K3 = 5x10-5 M und K4 = 5x10-3 M und die der H+-Bindung zu K6 = 10-8 M, K7 = 10-8 M, K8 = 10-6 M und K9 = 10-5 M bestimmt werden. Mit diesen Parametern konnten die experimentellen Daten sehr gut beschrieben werden. Sie stimmen weitgehend mit den apparenten Konstanten überein.<br />Durch die Zugabe von ATP und in Anwesenheit von 1 mM Mg2+ und 14 µM Ca2+ befindet sich das Enzym vorwiegend in der P-E2 Konformation.<br />Die Ionenbindung an das Enzym im E2-P-Zustand konnte nur durch ein Schema simuliert werden, in dem ein Zustand mit einbezogen wurde, in dem ein Proton und ein Ca2+ gebunden sind (Schema IIb, Fig. 36). Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante der Ionenbindung betrug für die Bindung des ersten Protons K3 = K3* = 2x10-6 M (pK 5.7). Die Affinität für das zweite Proton betrug K4 = 10-5 M (pK 5). Die Halbsättigungskonstanten für das erste Ca2+ wurde auf K2 = K2* = 4x10-4 M festgesetzt und die des zweiten Ca2+ auf K1 = 2.5x10-2 M. Die Bindung des ersten Protons, bzw. Ca2+ wurde hierbei unabhängig von der Bindung der jeweiligen anderen Ionenspezies gewählt.<br />Zeitaufgelöste Kinetiken der Partialreaktionen wurden untersucht, indem ATP und Ca2+ aus ihren caged Komponenten durch Laserblitze freigesetzt wurden.<br />Nach der sprunghaften Freisetzung von ATP konnte eine ansteigende und eine abfallende Phase der Fluoreszenz von 2 BITC beobachtet werden, welche der Ca2+ Freisetzung bzw. Protonenbindung in P-E2 zugeordnet wurden. Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der ansteigenden Phase wurden für niedrige pH-Werte dem Reaktionsschritt (Ca2)E1P -> P-E2(Ca2) mit 33 ± 2 s-1 zugeordnet und für hohe pH Werte der Freisetzung des ATP. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der fallenden Phase wurde für hohe pH-Werte als P-E2* -> P-E2 mit 0.4 ± 0.2 s-1 bestimmt und für pH < 6 mit 1.1 ± 0.1 s-1. Das Standard-Post-Albers-Schema musste um diesen zusätzlichen Schritt erweitert werden.<br />Um die cytoplasmatischen Ionenbindungs- und freisetzungsschritte zu untersuchen, wurden Ca-Konzentrationssprungexperimente durchgeführt, in denen Ca2+ aus caged Ca freigesetzt wurde. Dabei wurde eine Abnahme der 2BITC-Fluoreszenz beobachtet. Es konnten eine schnelle und eine langsame Komponente mit t1 (mit 2 ms < t1 < 8 ms) und t2 (mit 50 ms < t2 < 200 ms) aufgelöst werden. t1 besitzt eine ähnliche pH-Abhängigkeit wie t2. Hierbei konnte durch die Analyse des einfachen Reaktionsschemas ausgeschlossen werden, dass die pH-Abhängigkeit durch die Bindung eines Protons in den Ca2+-Bindungsstellen zustande kommt. Die pH-Abhängigkeit lässt sich möglicherweise durch eine allosterische Bindung eines Protons an einen der drei Aspartatreste (Asp813, Asp815, Asp817) im Loop L67 erklären. Das Aspartat müsste erst deprotoniert werden, bevor das jeweilige Ca2+ auf dem Weg in die Bindungsstelle vorübergehend an den Loop binden kann. Die Annahme des gleichen Mechanismus für die Sequenzen steht nicht im Widerspruch zu den signifikant verschiedenen Aktivierungsenergien (t1: EA ~ 30 - 50 kJ/mol und t2: EA ~ 60 - 70 kJ/mol), da davon ausgegangen werden kann, dass die Membrandomäne des Enzyms im Zustand CaE1 unbeweglicher ist als im unbesetzten E1-Zustand, z.B. durch eine Koordination des ersten Ca2+ in der Ionenbindungsstelle mit einer Aminosäure der Helix M6. Kinetics of the SR Ca-ATPase 2011-03-24T17:30:09Z deposit-license 2011-03-24T17:30:09Z 2004 Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase Peinelt, Christine Peinelt, Christine

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