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Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives : Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition

Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives : Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition

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Prüfsumme: MD5:f4bc93a74ea3ef2c0cf09a14701fe392

STIMAC, Robert, 2005. Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives : Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Stimac2005Macro-6641, title={Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives : Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition}, year={2005}, author={Stimac, Robert}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

deu Stimac, Robert Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives: Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition Macrocyclic Carbon Suboxide Derivatives : Novel Potent Inhibitors of the Na,K-ATPase, and their Mechanism of Inhibition Eine neue Klasse starker Inhibitoren der Na,K-ATPase wurde von uns zuerst aus Helleborus purpurascens isoliert. Indem das Protein in einem bestimmten Zustand blockiert wird, können unbekannte Zwischenzustände des Reaktionszyklus sowie Struktur-Funktionsbeziehungen aufgedeckt werden. Im Gegensatz zu den wohlbekannten Herzglykosid-Inhibitoren der Na,K-ATPase (Digitalis aus dem Fingerhut), inhibieren diese neuen Inhibitoren nicht nur Kaninchen-Na,K-ATPase, sondern mit ähnlicher Wirksamkeit auch Na,K-ATPase aus der Rattenniere, die eine viel niedrigere Affinität für Herzglykoside hat und sogar SR-Ca-ATPase und H,K-ATPase aus dem Magen. Die chemische Struktur der neuen Inhibitoren kann vom einfachen anorganischen Gas Kohlensuboxid (C3O2) abgeleitet werden. Hexamere und Oktamere dieser Substanz bilden makrozyklische Ringe, die als makrozyklische Kohlenstoffsuboxid-Derivate (MCS) bezeichnet werden.<br />Die Bindestelle der Na,K-ATPase für Herzglykoside ist stark konserviert, und könnte eine mögliche Bindestelle für endogene, digitalisartige Faktoren (EDLF auf Englisch) in Tieren sein. Wegen vielen gemeinsamen chemischen Eigenschaften von MCS-Faktoren und früher beschriebenen EDLFs wurde eine Untersuchungen des Aktionsmechanismus angeregt um eine mögliche Identität der beiden Substanzen zu klären.<br />Die stark konservierte Herzglykosidbindestelle liegt auf der extrazellulären Seite der Na,K-ATPase. Deshalb war eine der Hauptanforderungen an die MCS-Faktoren, um als EDLF in Betracht zu kommen, dass sie an die extrazelluläre Seite der Na,K-ATPase binden. Experimente mit Na,K-ATPase enthaltenden Lipidvesikeln und Kompetitionsexperimente mit anderen bekannten Inhibitoren weisen darauf hin, dass MCS-Faktoren - im Gegensatz zu Ouabain - eher von der intrazellulären Seite auf die Na,K-ATPase wirken und somit nicht als typischer EDLF in Frage kommen.<br />Bezüglich des Aktionsmechanismus wurde die Bindung von MCS-Faktoren an die Na,K-ATPase mit dem fluoreszierenden Styrylfarbstoff RH421 untersucht. Der Styrylfarbstoff detektiert Veränderungen in der Membrankapazität, die z.B. durch Ionen verursacht werden, die von Proteinen durch die Membranen transportiert werden. In sogenannten ´Standardexperimenten´ wurden sättigende Konzentrationen von MCS-Faktoren zur Na,K-ATPase hinzugegeben. In diesen Experimenten kann das Protein vornehmlich in den Zuständen H2E1, Na3E1, E2P und (K2)E2 vorliegen. Es wurde beobachtet, dass nur die Konformation E1 von dem Inhibitor beeinflusst wird. Nachfolgende Titrationen der MCS-Faktoren zum Zustand E1, zeigten eine Zunahme der Fluoreszenz in der Größe wie sie erwartet würde, wenn ein Kation aus dem Enzym freigegeben wird. Diese Fluoreszenzzunahme wurde auch in Anwesenheit von Na+- und K+-Ionen beobachtet. Die Größe der Fluoreszenzänderung war abhängig vom pH der Lösung. Ausgehend von einer einfachen Reaktionsgleichung für die Bindung von Protonen an die Na,K-ATPase konnte ein Modell einer Reaktionsgleichung erstellt werden, das in der Lage war, alle experimentell erlangten Daten zu simulieren. Das Modell beinhaltet vier Zustände in denen MCS-Faktoren an die Na,K-ATPase gebunden sind und in denen ebenfalls immer ein Kation an das Enzym gebunden ist. Die Abhängigkeit vom pH wurde darauf zurückgeführt, dass MCS-Faktoren bei niedrigem pH protoniert werden und dadurch in eine aktivere Form überführt werden. Ein ähnlicher, aber viel kleinerer Effekt wurde auch bei höheren Na+- und K+-Konzentrationen beobachtet. Auf diese Veränderungen der Inhibitoraktivität weisen auch die Aktivierungsprozedur und die Enzymaktivitätstests hin, bei denen Veränderungen der Aktivität in Abhängigkeit von Kationenkonzentrationen im Puffer registriert wurden.<br />Abschließend kann man sagen, dass eine neue Klasse von Inhibitoren der P-Typ ATPasen charakterisiert wurde, die mehrere Typ II P-Typ ATPasen stark inhibiert. Die MCS-Faktoren binden bei der Na,K-ATPase an einer spezifischen Bindestelle auf der zytoplasmatischen Seite des Proteins. Dadurch wird eine Konformationsänderung induziert, die eine Veränderung in der Gleich­gewichts­dis­soziationskonstante für eine der ersten beiden intrazellulären Kationen­bindestellen bewirkt. Nur auf diese Studie basierend, kann den MCS-Faktoren keine physiologische Rolle zugesprochen werden. Die verblüffenden chemischen Ähnlichkeiten der MCS-Faktoren mit vorausgegangenen publizierten Eigenschaften von EDLFs, wurden durch weitere, gemeinsame Eigenschaften bestärkt. Die grundlegende Erwartung an EDLFs an die konservierte extrazelluläre Herzglykosidbindestelle zu binden, konnte von MCS-Faktoren nicht erfüllt werden. Trotzdem bleibt die Tatsache bestehen, dass diese Verbindung in essbaren Pflanzen vorkommt und somit in tierische Körper aufgenommen wird. Diese Studie zeigt eindeutig, dass eine Interaktion zwischen MCS-Faktoren und Typ II P-Typ-ATPasen prinzipiell möglich ist. Ob eine signifikante Interaktion dieser Art tatsächlich stattfindet, wird in physiologischen Studien untersucht werden müssen. deposit-license 2005 Stimac, Robert 2011-03-24T17:28:00Z 2011-03-24T17:28:00Z application/pdf

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