Type of Publication: | Dissertation |
URI (citable link): | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-18931 |
Author: | Koota, Juha |
Year of publication: | 2006 |
Title in another language: | Mechanisches Strecken und Lichtstreuung an DNA |
Summary: |
The goal of the present work was to establish robust and reliable methods for the preparation and characterization of dense carpets of long-chain DNA attached with both ends simultaneously to the surfaces of a surface force apparatus. This provides the perspective of an experimental platform of studying strongly extended DNA with structure-sensitive methods such as X-ray scattering or optical birefringence. This approach should allow to elucidate the (so far unresolved) structural origin of the plateau in the force-extension curve observed in the single-molecule experiments, and to study the role of protein binding in large-scale structural changes in genomic DNA.
In comparison to traditional single-molecule force experiments, the controlled stretching of a large ensemble of DNA molecules using a surface-force apparatus imposes stringent conditions to sample preparation: (i) the end-grafting of DNA to the substrate has to be strong enough allowing overstretching of the molecules, (ii) the end-grafting has to be specific for given substrate and finally (iii) in order to obtain measurable X-ray scattering or birefringence signals, the carpets, in addition to the above mentioned criteria, should ideally be prepared at densities at which the DNA forms brushes. In this work we have thus developed, on the one hand, an experimental route to the preparation of dense, strongly anchored DNA carpets suitable for surface force experiments, and, on the other hand, new methods to characterize tethering density and mechanical stability under external force. The mechanical stability of DNA-surface links has been improved by using long-chain DNA end-labeled with multiple biotins on one end and a thiol group on the other end.. This characterization was done by using direct observation of rupture events under external force in a confocal fluorescence microscope coupled to a simple extension device. We succeeded in characterization the mechanical stability of large ensembles of double-end-tethered DNA, clearly distinguishing single biotin from multiple biotin tethering. In addition we found that the end-modification of long-chain DNA with short oligonucleotides does not always provide the needed mechanical stability for stretching and that streptavdin (the biotin-binding protein) is not always strongly enough coupled to the substrate. This lead us to develop PCR (Polymerase Chain Reaction) synthesis of long-chain DNA end-labeled with multiple biotins on one end and a thiol group on the other end, The use of PCR, in principle, eliminates the problem of oligonucleotide ligation as the molecule is synthesized completely with its end-modifications. Additionally we have developed alternative end-grafting possibilities for long-chain DNA molecules so circumventing the problems found in streptavidin-surface grafting. Furthermore we have developed a new reversible combing method which indicates enhanced DNA tethering density. This method is based on unspecific electrostatic absorption of end-grafted DNA molecules to the surface which is previously elongated by a hydrodynamic flow. Through multiple combing of new DNA fractions, a systematic enhancement of the tethering density can be achieved, possibly allowing to produce DNA carpets at brush densities since the molecules can be released from the surface. Finally, evanescent wave quasi-elastic light scattering has been established as a sensitive tool for the detection of sub-monolayers of DNA tethered to solid substrates. This method might thus provide a new, marker-free method for the quantification of DNA tethering densities. |
Summary in another language: |
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung einer zuverlässigen Methoden der Herstellung und Charakterisierung dichter Teppiche mit langkettiger DNS, die beidseitig zwischen zwei Oberflächen einer Kraftapparatur end-angeheftet ist. Damit wurde eine experimentelle Plattform geschaffen, um ueberstrecte DNS mit strukturaufklärenden Methoden wie Röntgenstreuung oder optischer Doppelbrechung untersuchen zu können Mit dieser Methode soll der bisher unbekannte strukturelle Ursprung des Plateaus in den Kraft-Ausdehnungs Messungen an einzelnen Molekuelen aufgeklärt werden. Weiterhin ist der Einfluss der Proteinbidung bei langreichweitig Strukturänderung in DNS von Interesse.
Im Vergleich zu traditionellen Einzelmolekuel-Kraftexperimenten, benötigt das kontrollierte Strecken eines grossen Ensembles von DNS Molekuelen mittels Oberflächen-Kraft Apparatur, strenge Bedingungen der Proben Herstellung: (i) die Endanheftung der DNS zum Substrat muss stabil genug sein um das Ueberstrecken der Molekuele zu ermöglichen. (ii) Die Bindung muss spezifisch am Substrat erfolgen. (iii) Um Röntgenstreuung oder Doppelbrechung des Teppiches mit obengenanten Kriterien zu erzielen, sollten die Molekuele idealerweise dicht gepackt auf dem Substrat angeheftet sein (brush regime). In dieser Arbeit haben wir eine expermentelle Methode entwickelt, welche alle diese Kriterien erfuellt. Weiterhin wurden neue Methoden zur Messung von Molekueldichten und der mechanischen Stabilität von Bindungen unter Kraftanwendung entwickelt. Die mechanische Stabilität der DNS-Oberflächen Bindung konnte durch den Einsatz von multi Biotin an einem und Thiol am anderen Ende modifizierter langkettiger DNS verbessert werden. Die Characterisierung erfolgte durch direkte Beobachtung der Abreissereignisse unter Kraftanwendung im Konfokalen Fluoreszenz Mikroskop, mit Hilfe eines einfachen Streckaufbaus. Dadurch gelang die Charakterisierung der mechanischen Stabilität eines grossen Ensembles doppelseitig angehefteter DNS mit klaren Unterschieden zwischen jeweils einzelner und multipler Biotinmodifikation an deren Ende. Ausserdem konnten wir feststellen, dass die Endmodifikation langkettiger DNS mit kurzen oligonukleotiden nicht immer die benötigte mechanische Belastbarkeit fuer Streckexperimente gewährleistet, und dass Streptavidin (das Biotin bindende Protein) nicht immer fest genug an das Substrat gekoppelt ist. Diese Erkenntnisse fuehrten zu der Polymerase Ketten Reaction (PCR) Synthese langkettiger DNS endgelabelt mit multiplen Biotinen an einem Ende und einer Thiolgruppe am anderen Ende. Durch die Einsatz der PCR wurden die Probleme der Oligonukleotid Ligation beseitigt, da wir die Molekuele komplett mit ihren Endmodifikationen synthetisierten. Ausserdem umgingen wir die Probleme der Streptavidin-Oberflächen Bindung durch die Entwicklung alternativer Endandheftungsmethoden. Es wurde eine neue reversible Combing Methode entwickelt, mit deren Hilfe die Endanheftungsdichte von DNS erhöht werden kann. Diese Methode basiert auf dem Prinzip der unspezifischen elektrostatischen Absorption an der Oberfläche von endangehefteter DNS, die zuvor durch hydrodynamischen Fluss gestreckt wurde. Durch das wiederholte Combing neuer DNS Fraktionen, kann die Endanheftungsdichte systematisch erhöht werden. Eventuell ermöglicht dies die Herstelllung von DNS Teppichen im brush Regime, da sich die Molekuele von der Oberfläche wieder aufstellen lassen. Abschliessend ist mit der Evaneszenten quasi-elastischen Lichtstreuung eine empfindliche Methode zur Untersuchung von sub-monolagen angehefteter DNS auf festen Substraten Entwickelt worden. Mit dieser Methode kann eine neue quantitative Dichtebestimmung von angehefteter DNS ohne Marker erreicht werden. |
Examination date (for dissertations): | Jul 7, 2006 |
Dissertation note: | Doctoral dissertation, University of Konstanz |
Subject (DDC): | 530 Physics |
Controlled Keywords (GND): | DNS, Polymerase-Kettenreaktion |
Keywords: | überstreckte DNS, dynamische Lichtsteuung mit evaneszenten Wellen, DNS Teppich, PCR, Oberflächenfunktionalisierung, overstretched DNA (S-DNA), soft combing, evanescent wave dynamic light scattering, DNA carpet, long chain PCR |
Link to License: | In Copyright |
KOOTA, Juha, 2006. Mechanical Streching and Lightscattering on DNA [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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Koota_Diss.pdf | 1180 |