Konfokale Mikroskopie mit neuartigen Femtosekunden-Lichtquellen

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Datum
2009
Autor:innen
Träutlein, Daniel
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Open Access-Veröffentlichung
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Titel in einer weiteren Sprache
Confocal microscopy with novel femtosecond light sources
Forschungsvorhaben
Organisationseinheiten
Zeitschriftenheft
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anwendung Femtosekunden-Faserlaser in der Mikroskopie. In der konfokalen Mikroskopie fehlt es nach wie vor an stabilen, einfach zu bedienenden Femtosekunden-Lichtquellen.
Faserlaser-Systeme können diese Lücke schließen, denn sie sind sehr robust. Des Weiteren zeichnen sie sich durch hervorragende Stabilität aus und sind durch verschiedene Möglichkeiten der Frequenzkonversion sehr flexibel. Durch das parallele Hochverstärken in Mehrarm-Systemen eignen sie sich prinzipiell auch für Techniken wie STED - und CARS -Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion und Coherent Anti-Stokes Raman
Scattering) [Kra09], bei denen verschiedene synchronisierte Laserstrahlen erforderlich sind. Diese Techniken benötigen bisher komplizierte und teure Lasersysteme und könnten durch einfachere Lichtquellen eine weite Verbreitung finden. Dabei zeichnen sich die Faserlaser durch ihre exzellenten Rauscheigenschaften und die nahezu perfekte Synchronisation mehrerer Verstärkerarme aus [Adl07]. Da es sich bei den verwendeten Systemen um gepulste Quellen handelt, können sie auch für Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen (FLIM) eingesetzt werden.
Nach einer kurzen Einführung wird der Aufbau eines Konfokalmikroskops mit einem Femtosekunden-Er:Faserlaser als Lichtquelle beschrieben. Dieses System besticht durch seine Vielseitigkeit, da die Lichtquelle sowohl
die lineare als auch die nichtlineare konfokale Anregung in verschiedenen Wellenlängenbereichen ermöglicht. Die hervorragenden Rauscheigenschaften des Systems wurden demonstriert und mit anderen Quellen verglichen.
Um die Ausgangsleistung des Systems zu steigern, wurde ein Yb:Faserverstärker entwickelt. Dabei kamen Multimoden-gepumpten Doppelkernfasern zum Einsatz. Parallel dazu wurde ein Singlemode-Verstärker aufgebaut. Beide Verstärker wurden mit dem in einer hoch-nichtlinearen Faser generierten Superkontinuum geseedet. Dieser neuartige Ansatz stellt eine ausgezeichnete Femtosekunden-Seed-Quelle für Yb-dotierte Hochleistungsverstärker dar.
Der Schwerpunkt der Anwendung des entwickelten Aufbaus lag in der konfokalen Photomanipulation lebender Zellen. Dabei wurde die zelluläre DNA mit hoher räumlicher Auflösung über Multiphotonen-Absorption geschädigt. Zunächst wurde die räumliche Ausdehnung der induzierten DNA-Läsionen untersucht und gezeigt, dass das geschädigte Volumen im sub-Femtoliter-Bereich liegt. In den zuvor von anderen Gruppen durchgeführten Experimenten wurde in einem Wellenlängenbereich zwischen 750 nm und 800 nm bestrahlt. Dabei ist immer die fehlende Selektivität bemängelt worden, da sowohl Photoprodukte als auch oxidative Schäden erzeugt
werden. Diese Arbeit stellt Ergebnisse vor, die belegen, dass es möglich ist, bei 1050 nm spezfisch DNA-Strangbrüche zu induzieren. Der quantitative Vergleich zwischen der Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 775 nm und bei 1050 nm zeigte, dass bei letzterer keine UV -Photoprodukte nachweisbar sind. Dies wurde über immuncytochemische Färbungen ermittelt. Durch diese Beobachtungen war es erstmals möglich, Bedingungen zufinden, die selektiv Strangbrüche induzieren. Außerdem wurde erstmals das Schadensspektrum bei unterschiedlichen Wellenlängen systematisch untersucht.
Der letzte Teil der Arbeit konzentriert sich auf XPC, ein Protein, welches die Identfizierung von UV -Photoprodukten in der Nukleotidexzissionsreparatur übernimmt [Cam09]. Zusammen mit der Arbeitsgruppe um Professor H. Nägeli in Zürich konnten wir den Bereich des Proteins identfizieren, der für die Bindung an die Läsion zuständig ist. Dazu wurden verschiedene XPC-Fragmente in lebenden Zellen exprimiert. Nach der Schädigung der DNA in einem kleinen Volumen wurde die Rekrutierung an den Ort des Schadens beobachtet. Mit dieser Technik konnten wir einen minimalen Sensor für DNA-Läsionen identfizieren.
Zum Abschluß wird die quantitative Auswertung und Simulation der Experimente besprochen. Diese Versuche stehen allerdings erst am Anfang.
Dennoch kann dabei der Einfluss einzelner Parameter auf die Akkumulation nachvollzogen werden. Für zukünftige Simulationen sollten jedoch einige Parameter zusätzlich bestimmt werden. Insbesondere fehlen bisher
quantitative Angaben über die Konzentrationen der einzelnen Proteine in den Zellen unter physiologischen Bedingungen.
Der vorgestellten Leistungsparameter jedoch in den meisten Fällen.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

In this work we demonstrate the application of femtosecond fiber lasers as a reliable and powerful laser source for confocal microscopy. Lack of robust turn-key and versatile laser sources still hamper widespread application of nonlinear microscopy.
Femtosecond fiber lasers have the potential to overcome this. Their excellent stability and the possibility to get various wavelengths via nonlinear frequency conversion are strong advantages. Systems with multiple amplifiers seeded by one oscillator allow complicated techniques like STED- and CARS-microscopy (stimulated emission depletion and coherent anti-stokes raman scattering microscopy).
These methods need several synchronized laser beams at different wavelengths and need therefore special equipment.
The advantages of femtosecond fiber lasers are shown. Further, we boost their options, by amplifying parts of the supercontinuum with a Yb:fiber amplifier. Two different designs implementing singlemode and double-clad fiber are compared.
In addition, several applications are demonstrated. We focused on confocal photomanipulation in living cells. Femtosecond light pulses were employed to induce DNA-damage via multiphoton absorption. The kind of DNA-lesions generated in this way was characterized in this work. With the developed techniques DNA-repair - especially the detection of DNA-lesions by the repair protein XPC - was examined.

Fachgebiet (DDC)
500 Naturwissenschaften
Schlagwörter
Femtosekunden-Faserlaser, confocal microscopy, femtosecond fiber laser, DNA-damage
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690TRÄUTLEIN, Daniel, 2009. Konfokale Mikroskopie mit neuartigen Femtosekunden-Lichtquellen [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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October 23, 2009
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