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Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone

Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone

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Prüfsumme: MD5:b788a91dfee710fcebeff3e557263d91

DULLIUS, Carlos Henrique, 2011. Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Dullius2011Physi-14119, title={Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone}, year={2011}, author={Dullius, Carlos Henrique}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

2011-07-21T08:31:59Z eng 2011-07-21T08:31:59Z 2011 Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Physiologie und Biochemie des anaeroben Abbaus von Isopropanol und Aceton, sowie auf die Aufklärung von Reaktionsmechanismen, welche am Acetonabbau in anaeroben Bakterien beteiligt sind. Untersucht wurden diese physiologischen und biochemischen Aspekte in syntrophen, methanogenen Anreicherungen, sulfatreduzierenden Bakterien und nitratreduzierenden Stämmen, welche dafür angereichert und isoliert wurden.<br /><br /><br />Die Abbaureaktionen von Isopropanol und Aceton wurden mit wachsenden Kulturen und in dichten Zellsuspensionen von methanogenen, syntrophen Co-Kulturen, welche auf Isopropanol oder Aceton angereichert und vorkultiviert wurden, nachgewiesen. Bakterielle Organismen aus den angereicherten Co-Kulturen, welche für den Abbau von Isopropanol und Aceton verantwortlich waren, wurden isoliert und phylogenetisch eingeordnet. Ein isolierter, isopropanolabbauender Organismus konnte durch Sequenzierung und Alignment des Gens der 16S rRNA als Methanospirillum hungatei identifiziert warden. Die Analyse der 16S rDNA eines unbekannten, acetonfermentierenden Organismus aus der angereicherten Co-Kultur KN-Act zeigte phylogenetische Ähnlichkeit mit einem Organismus der Gattung Desulfosporosinus.<br /><br /><br />In Abbauexperimenten mit wachsenden Kulturen und dichten Zellsuspensionen konnten mögliche Abbauwege, welche am anaeroben Isopropanol- und Acetonabbau beteiligt sind, nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines bereits vermuteten, membrangebundenen, von Natriumionen abhängigen Transportsystems, welches die Energie zur anaeroben Aktivierung des Acetonmoleküls zur Verfügung stellt, konnte gezeigt werden. Der Abbau von Acetat durch methanogene Bakterien in der Co-Kultur KN-Act war Natrium-abhängig. Eine Akkumulierung von Acetat im Kulturmedium fand nur statt, wenn der methanogene Partner durch Bromethansulfonat gehemmt wurde.<br /><br /><br />Ein Stamm von Desulfococcus biacutus wurde verwendet, um die acetonabbauenden Reaktionswege in sulfatreduzierenden Bakterien aufzuklären. Das Einfügen eines Kohlenstoffmonoxidmoleküls in organische Verbindungen wie Aceton (Reppe Carbonylierung von Alkenen) erschien plausibel für den anaeroben Acetonabbau durch D. biacutus. Das Vorhandensein von spezifisch induzierten Enzymen, welche im Acetonmetabolismus beteiligt sind, und die mögliche Beteiligung eines Carbonylierungssystems konnte in zellfreien Extrakten von D. biactus nach anaerober Kultivierung mit Aceton und Sulfat nachgewiesen werden. Zwei weitere Strategien wurden in dichten Zellsuspensionen von D. biacutus nachgewiesen. Eine davon ist der Anstieg der Acetonabbauraten durch Zugabe von Fumarat mit der nachweislichen Bildung von 2-Oxopropylsuccinat ähnlich wie in der β-Oxidation von Pyruvat und Succinat.<br /><br /><br />Eine Aceton carboxylierende Reaktion wurde in zellfreien Extrakten aus drei verschiedenen nitratreduzierenden Stämmen nachgewiesen: Paracoccus denitrificans, P. pantotrophus, und dem neu isolierten, acetonabbauenden, nitratreduzierenden Stamm KN Bun08. Anfangs wurden in vitro Experimente mit zellfreiem Rohextrakt aus nitratreduzierenden Organismen, welche zuvor anaerob auf Aceton und Nitrat kultiviert wurden, gemacht. Für den Nachweis der Acetoncarboxylierungsreaktion wurde ein modifizierter, mit den Hilfsenzymen Adenylatkinase (EC 2.7.4.3), auch Myokinase genannt, Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40) and Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27) gekoppelter Enzymtest entwickelt, in dem NADH oxidiert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Acetoncarboxylierungsreaktion in zellfreien Extrakten mit angereicherter Acetoncarboxylase aus auf Aceton gewachsenen Zellen von P. denitrificans, P. pantotrophus und Stamm KN Bun08 zu sehen war. Die Aktivität der ATP-abhängigen Acetoncarboxylase wurde durch die ATP-Bildung und NADH-Oxidation in kontinuierlichen, spektrophotometrischen Untersuchungen nach chromatographischen Anreicherungen der Acetoncarboxylase mit zwei Anreinigungsschritten mit einer DEAE-Sepharose Säule nachgewiesen. Enzymaktivitäten von 0,4; 0,03 und 0,2 U/mg Protein wurden nachweislich in Extrakten aus P. denitrificans, P. pantotrophus and KN-Bun08 nach der zweiten Aufreinigung mit der DEAE-Sepharose Säule gemessen. Die Aktivität war abhängig von der Aceton- und ATP- Zugabe und hing zusammen mit dem Proteingehalt im Reaktionsmix. Nach dem letzten Aufreinigungsschritt konnten drei Untereinheiten der Acetoncarboxylase (Alpha, Beta und Gamma Untereinheiten) mit SDS-PAGE sichtbar gemacht werden und mit Hilfe der Massenspektroskopie identifiziert werden.<br /> Dullius, Carlos Henrique Physiology and biochemistry of the anaerobic biodegradation of isopropanol and acetone deposit-license Dullius, Carlos Henrique

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