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Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

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KOPP, Kathrin, 2011. Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

@phdthesis{Kopp2011Entwi-14061, title={Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen}, year={2011}, author={Kopp, Kathrin}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

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Die Verwendung von DNA Arrays zur Erstellung von Genexpressionsprofilen im Hochdurchsatzverfahren ist zu einem festen Bestandteil der molekularbiologischen Forschung geworden. Im Gegensatz dazu kann die Untersuchung von Proteinen hinsichtlich ihrer Einbindung in zelluläre Signalnetzwerke bisher nur minimal in parallelen Ansätzen durchgeführt werden. Protein Arrays bieten eine gute Möglichkeit, um auch diese Untersuchungen in großem Maßstab durchführen zu können und somit Einblicke in die Beteiligung einzelner Proteine an verschiedenen Signalwegen zu bekommen. So stellen beispielsweise Protein Arrays mit immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix eine sehr gute Möglichkeit dar, um Proteine in kürzester Zeit auf Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen mit allen im menschlichen Genom kodierten SH2 Domänen zu untersuchen. Mit der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für eine solche globale Protein-Protein Interaktionsanalyse gelegt. Etwa zwei Dutzend humane SH2 Domänen wurden rekombinant als GST-Fusionsproteine exprimiert, aufgereinigt und auf einer Trägeroberfläche immobilisiert. Durch Verwendung von Aldehydoberflächen als Trägermatrix wurde eine robuste, da kovalente, Bindung der Proteine an die Oberfläche erreicht. Die nicht durch SH2 Domänen abgesättigten Aldehydgruppen der Oberfläche wurden mittels Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert, wodurch die unspezifische Bindung von Proteinen der Beprobungslösung effektiv verhindert wurde. Ebenso erfolgreich war auch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit Ganzzelllysaten und die anschließende Detektion der gebundenen Phosphotyrosinproteine durch spezifische Antiköper. Die erfolgreiche Verwendung unterschiedlicher Antikörper zur Detektion zeigt die breite Anwendbarkeit des SH2 Domänen Arrays zur Untersuchung verschiedenster Proteine und Proteingruppen. In diesem Zusammenhang konnten Membranproteine wie CEACAM3 und CEACAM4, die zytoplasmatisch lokalisierende Fokale Adhäsionskinase (FAK) sowie die Gesamtheit der tyrosinphosphorylierten Proteine einer Zelllinie hinsichtlich ihrer Bindefähigkeit an unterschiedliche SH2 Domänen untersucht werden. Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnten sowohl bereits bekannte als auch bisher unbekannte Interaktionspartner für den phagozytischen Rezeptor CEACAM3 identifiziert werden. Die nähere Analyse der neu identifizierten Interaktionspartner, Grb14 und Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3K), gaben Einblicke in die Beteiligung dieser Proteine an CEACAM3-vermittelten Signalwegen und bestätigten somit die physiologische Relevanz dieser Interaktionen. So konnte das Signalprotein Grb14 als Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose identifiziert werden, während die PI3K für die Abtötung der internalisierten Pathogene von essentieller Bedeutung ist. Durch die Anwendung des SH2 Domänen Arrays zur Interaktionspartnersuche für CEACAM4, den evolutionären Vorläufer von CEACAM3, konnten sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede im Bindungsverhalten dieser Proteine an verschiedene SH2 Domänen ermittelt werden. Genau wie für CEACAM3 konnten auch für CEACAM4 phosphorylierungsabhängige Assoziationen mit den SH2 Domänen der Src-Kinase Yes, dem Adapterprotein Nck2 und der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K festgestellt werden. Da für CEACAM4 kein natürlicher Ligand bekannt ist, wurden erste funktionelle Untersuchungen nicht mit CEACAM4 selbst, sondern unter Einsatz eines chimären Proteins, durchgeführt. Diese Chimäre bestand aus der OpaCEA-bindenden N-terminalen Domäne des phagozytischen Rezeptors CEACAM3 und dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 und ermöglichte die Beobachtung der Lokalisation sowie Untersuchung der Funktion der neu identifizierten Interaktionspartner im Infektionsverlauf. Neben diesen Gemeinsamkeiten wurden allerdings auch interessante Unterschiede zwischen CEACAM3 und CEACAM4 festgestellt. So konnte weder für den neu identifizierten Negativregulator, der CEACAM3- vermittelten Phagozytose, Grb14 noch für den, für die Phagozytose über CEACAM3 essentiellen, Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4 gefunden werden. Diese Befunde deuten trotz enger Verwandtschaft beider Rezeptoren auf abweichende Signalwege hin.</dcterms:abstract> <dcterms:rights rdf:resource="http://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:352-20140905103605204-4002607-1"/> <dcterms:available rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2013-06-30T22:25:05Z</dcterms:available> <dcterms:hasPart rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/14061/2/Dissertation_Kopp.pdf"/> <dcterms:issued>2011</dcterms:issued> <void:sparqlEndpoint rdf:resource="http://localhost/fuseki/dspace/sparql"/> <dc:rights>deposit-license</dc:rights> <dc:date rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2011-07-12T10:53:40Z</dc:date> <dc:contributor>Kopp, Kathrin</dc:contributor> <bibo:uri rdf:resource="http://kops.uni-konstanz.de/handle/123456789/14061"/> <dc:creator>Kopp, Kathrin</dc:creator> </rdf:Description> </rdf:RDF>

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