Functional analysis of the ubiquitously conserved protein GCP1 from Escherichia coli

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Functional analysis of the ubiquitously conserved protein GCP1 from Escherichia coli
Forschungsvorhaben
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Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
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Zusammenfassung

GCPs sind als vermeintliche Glykoproteasen, die in allen Lebewesen mit bekannter Genomsequenz vorkommen beschrieben. Dabei ist die Aminosäuresequenz der Proteine hoch konserviert. Sie beinhalten zwei Histidine, die das vermutliche aktive Zentrum der Protease darstellen, und eine C-terminale HSP70-aktin Domäne.

Während dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Aufklärung der molekularen Funktion von GCP1 in Escherichia coli durchgeführt. Daten aus einer Computeranalyse der Aminosäuresequenz zur Membrantopologie deuteten darauf hin, dass GCP1 über zwei transmembranäre Helices in die Cytoplasmamembran integriert ist. Unter Verwendung eines in dieser Arbeit erzeugten Antikörpers gegen GCP1 konnte gezeigt werden das GCP1 wachstumsphasenabhängig reguliert wird und während des logarithmischen Wachstums in der Zelle akkumuliert. Das Protein liegt dabei sowohl löslich im Cytoplasma, als auch mit der inneren Membran assoziiert vor. Im Gegensatz zu anderen Wachstumsphasen befindet sich der weitaus größte Teil des Proteins während der frühen logarithmischen Phase an der Membran. Die HSP70-aktin Domäne des Proteins wurde auf die Interaktion mit möglichen anderen Proteinen hin untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass GCP1 direkt mit dem Zellteilungsprotein FtsZ interagiert. Es wurde gezeigt, dass eine gcp1 Deletion in E. coli zur Einstellung der Zellteilung und des Wachstums führt. Aus einer daraufhin konstruierten konditional letalen gcp1-Mutante wurden Hinweise auf die physiologische Funktion des GCP1 Proteins gewonnen. GCP1 liegt in der Zelle nur in geringer Konzentration vor. Selbst bei Deletion des gcp1-Gens ist diese Konzentration noch ausreichend, um einige weitere Teilungen der bakteriellen Zelle zu ermöglichen. Unter Verwendung einer FtsZ-Gfp Fusion, in Kombination mit der konditional letalen gcp1-Mutante, konnte gezeigt werden, dass die Depletion von GCP1 dazu führt, dass sich der Zellteilungsapparat nicht ausbilden kann. Ein spezifischer Nachweis von lebenden und toten Zellen zeigte, dass die Depletion von GCP1 die Zellen nicht tötet, sondern nur das Wachstum, bzw. die Zellteilung blockiert. Der Vergleich des Proteoms von GCP1-depletierten Zellen mit Kontroll-Zellen zeigte, dass trotz der Depletion von GCP1 weiterhin Proteinbiosynthese und Transkription abliefen. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass GCP1 bei der Zellteilung von E. coli eine wichtige Rolle zukommt.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

GCPs are described as putative glycoproteases that are ubiquitous in all living organisms with a sequenced genome. The amino acid sequence of the GCPs is highly conserved. It contains two histidines that presumably resemble the active center of the protease and an HSP70-actin like fold on the C-terminus.

Different experiments were performed during this study to solve the molecular function of GCP1 from Escherichia coli. Data from bioinformatical approaches on the amino acid sequence of the protein indicated, that GCP1 is an integral membrane protein located in the inner membrane of E. coli, spanning the membrane with two hydrophobic helices. An antibody against GCP1 was raised and it was demonstrated that GCP1 is regulated in a growth-phase dependent manner, accumulating during the logarithmic growth of E. coli. The protein locates soluble in the cytoplasm, as well as associated with the inner membrane. During early logarithmic growth, the majority of GCP1 locates at the membrane, while during other growth phases the majority of the protein is found in the cytoplasm. We used the HSP70-aktin domain for pull down experiments in order to identify potential protein-protein interactions of GCP1. It could be demonstrated that GCP1 directly interacts with the cell division protein FtsZ. A deletion mutant in gcp1 was engineered and revealed that the deletion of gcp1 led to cessation of growth. Thereupon a conditionally lethal gcp1-mutant was constructed and used to gather further information about the physiological function of the GCP1 protein. GCP1 is a low abundant but stable protein. Even after deleting gcp1, this concentration was sufficient to enable the cells to divide several times before they ceased growth. By combining an FtsZ-Gfp fusion with the conditionally lethal gcp1-mutant we could demonstrate that the depletion of GCP1 prevented the formation of the cell division apparatus, the so-called divisome of E. coli. A vital stain of GCP-depleted cells revealed that cells remained viable after the depletion, but cell division and growth were arrested. By comparing the proteome of depleted cells with control-cells, we demonstrated that despite the depletion of GCP1, protein biosynthesis and transcription still occurred. The results of this study suggest that GCP1 is involved in regulating cell division of E. coli.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
ygjD, gcp, glycoprotease, cell division, essential gene, ubiquitous gene, FtsZ, E. coli, Escherichia coli, highly conserved, basic principles of life, yeaZ
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Zitieren
ISO 690WEISS, Christian, 2009. Functional analysis of the ubiquitously conserved protein GCP1 from Escherichia coli [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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May 11, 2009
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