In vitro investigations on uptake and toxicity of cyanobacterial toxins
In vitro investigations on uptake and toxicity of cyanobacterial toxins
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2010
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Fischer, Andreas
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Dissertation
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Abstract
Within their 3.3 to 3.5 billion years of existance cyanobacteria became the most diverse and widespread group of prokaryotes and adapted to nearly any given habitat throughout the world. During this period of time they developed an enormous variety of secondary metabolites with predominantly unknown physiological function. Some of these chemically and structurally very diverse compounds have been in the focus of international research ever since their toxic potential on other organisms became known.
Especially the MCs and more recently the CYNs have drawn major attention due to their frequent and widespread occurence and numerous in part fatal incidents of animal and human poisonings. MCs are cyclic heptapeptides comprising more than 80 congeners, whereas CYNs are classified as alkaloids. They consist of a sulphated and methylated tricyclic guanidino moiety linked to a hydroxymethyluracil.
The primary mechanism underlying the toxicity of MCs emerged to be the potent inhibition of serine/threonine-specific PPs, in particular PP1 and 2A. The unique amino acid Adda has thereby been identified as the toxic moiety of the MC molecule. However, isolated Adda was shown to be inhibitory ineffective on PP1 activity. Corresponding effects on PP2A were not determined.
Therefore, the first part of this study served to provide the lacking information: As expected, isolated Adda also failed to inhibit the activity of PP2A which corroborates the common assumption that PP inhibition by MCs and, hence, by the structural closely related NODs requires both the Adda moiety and the remaining structural units of the maternal toxins.
In contrast to MCs, the molecular mode of action of the geno- and cytotoxic CYNs (i.e. inhibition of protein synthesis and generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization) is not completely understood and no information has so far been provided on its effects in human primary cells.
Furthermore, both toxins are known to primarily target the liver, but have been found to additionally affect other organs as well. Some members of the superfamily of organic anion transporting polypeptides (OATPs/SLCOs), that have been found to be expressed in nearly every organ/tissue, have been identified to be jointly responsible for the observed organotropism of the cell impermeant MCs (more precisely tritiated dihydro-MCLR and MCLR). Besides passive diffusion, these carriers or other members of the bile acid transport system have been suggested to also be involved in mediating the uptake of CYN.
Therefore, two further aims of the present study were:
to assess possible differences in the toxicokinetics (i.e. the uptake-mediated toxicity) of four different MCs (LR, RR, LW and LF) and as a prerequisite to compare the toxicodynamics (i.e. inhibition of serine/threonine-specific PPs) of these congeners
and to determine the cytotoxicity of CYN in primary human hepatocytes and liver OATP-expressing HEK293 cells to evaluate possible transport-dependent effects.
The experiments revealed that the four MC congeners investigated equipotently inhibit recombinant and cellular serine/threonine-specific PPs, but differed tremendously with regard to cytotoxicity in liver OATP-expressing HEK293 as well as primary human hepatocytes. Hence, these findings strongly suggest that MCs are taken up by OATP1B1 and OATP1B3 with varying affinities and lead to the assumption that the vast differences in the in vivo toxicity of MCs (e.g. MCLR and MCRR) can rather be attributed to congener-specific toxicokinetics than toxicodynamics.
In addition, primary hepatocytes appeared to be up to two orders of magnitude more susceptible to MCs induced cytotoxicity than the corresponding HEK293 OATP transfectants which highlights the importance to additionally employ primary cells in order to obtain physiologically more relevant results.
A further crucial finding was that MCLW and -LF elicited much higher toxicity in both primary human hepatocytes and OATP-expressing HEK293 cells than MCLR, the congener commonly considered as the most toxic. If this is found to be true for their in vivo toxicities as well, the current risk assessments and guideline values might have to be revised since those are based on MCLR toxicity only.
In contrast, OATP-associated toxicity was found to be far less relevant for CYN than for MCs. Cytotoxicity of CYN appeared to rather depend on the metabolic condition of the exposed cell types since the immortalized, hence, metabolically less active, OATP-expressing HEK293 cells were distinctly less susceptible than primary human hepatocytes. This suggests that the second mechanism in CYN totoxicity, i.e. the generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization, has a higher impact at acute concentrations than the inhibition of protein synthesis which is supported by previous findings in primary mouse hepatocytes.
Moreover, the present data indicate that passive diffusion is indeed a mechanism in the uptake of CYN as the viability of control vector-transfected HEK293 cells was only marginally less reduced than that of the respective OATP transfectants.
The final scope of this study was to analyze cyanobacterial dietary supplements for contaminations with MCs and the excitotoxic amino acid BMAA in order to assess the risk emanating from this potential source of intoxication.
Since BMAA could neither be detected in Spirulina nor Aphanizomenon flos-aquae based supplements these products unlikely constitute a threat with regard to this toxin that has been suggested to be produced by the vast majority of cyanobacteria.
On the contrary, the analyses revealed MCs to be common contaminants of Aphanizomenon flos-aquae containing supplements. All of the samples were tested positively and approximately half of them exceeded the maximal acceptable concentration of 1 µg MCLR equivalents/g dw defined by the Oregon Health Division.
In conclusion, this study provides crucial findings on the toxicity of MCs that might have considerable implications on present risk assessments and guideline values and gives further insight on the uptake and toxicity of CYN. Moreover, it clearly demonstrates that MCs pose a serious health risk for consumers of cyanobacterial dietary supplements based on A. flos-aquae.
Especially the MCs and more recently the CYNs have drawn major attention due to their frequent and widespread occurence and numerous in part fatal incidents of animal and human poisonings. MCs are cyclic heptapeptides comprising more than 80 congeners, whereas CYNs are classified as alkaloids. They consist of a sulphated and methylated tricyclic guanidino moiety linked to a hydroxymethyluracil.
The primary mechanism underlying the toxicity of MCs emerged to be the potent inhibition of serine/threonine-specific PPs, in particular PP1 and 2A. The unique amino acid Adda has thereby been identified as the toxic moiety of the MC molecule. However, isolated Adda was shown to be inhibitory ineffective on PP1 activity. Corresponding effects on PP2A were not determined.
Therefore, the first part of this study served to provide the lacking information: As expected, isolated Adda also failed to inhibit the activity of PP2A which corroborates the common assumption that PP inhibition by MCs and, hence, by the structural closely related NODs requires both the Adda moiety and the remaining structural units of the maternal toxins.
In contrast to MCs, the molecular mode of action of the geno- and cytotoxic CYNs (i.e. inhibition of protein synthesis and generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization) is not completely understood and no information has so far been provided on its effects in human primary cells.
Furthermore, both toxins are known to primarily target the liver, but have been found to additionally affect other organs as well. Some members of the superfamily of organic anion transporting polypeptides (OATPs/SLCOs), that have been found to be expressed in nearly every organ/tissue, have been identified to be jointly responsible for the observed organotropism of the cell impermeant MCs (more precisely tritiated dihydro-MCLR and MCLR). Besides passive diffusion, these carriers or other members of the bile acid transport system have been suggested to also be involved in mediating the uptake of CYN.
Therefore, two further aims of the present study were:
to assess possible differences in the toxicokinetics (i.e. the uptake-mediated toxicity) of four different MCs (LR, RR, LW and LF) and as a prerequisite to compare the toxicodynamics (i.e. inhibition of serine/threonine-specific PPs) of these congeners
and to determine the cytotoxicity of CYN in primary human hepatocytes and liver OATP-expressing HEK293 cells to evaluate possible transport-dependent effects.
The experiments revealed that the four MC congeners investigated equipotently inhibit recombinant and cellular serine/threonine-specific PPs, but differed tremendously with regard to cytotoxicity in liver OATP-expressing HEK293 as well as primary human hepatocytes. Hence, these findings strongly suggest that MCs are taken up by OATP1B1 and OATP1B3 with varying affinities and lead to the assumption that the vast differences in the in vivo toxicity of MCs (e.g. MCLR and MCRR) can rather be attributed to congener-specific toxicokinetics than toxicodynamics.
In addition, primary hepatocytes appeared to be up to two orders of magnitude more susceptible to MCs induced cytotoxicity than the corresponding HEK293 OATP transfectants which highlights the importance to additionally employ primary cells in order to obtain physiologically more relevant results.
A further crucial finding was that MCLW and -LF elicited much higher toxicity in both primary human hepatocytes and OATP-expressing HEK293 cells than MCLR, the congener commonly considered as the most toxic. If this is found to be true for their in vivo toxicities as well, the current risk assessments and guideline values might have to be revised since those are based on MCLR toxicity only.
In contrast, OATP-associated toxicity was found to be far less relevant for CYN than for MCs. Cytotoxicity of CYN appeared to rather depend on the metabolic condition of the exposed cell types since the immortalized, hence, metabolically less active, OATP-expressing HEK293 cells were distinctly less susceptible than primary human hepatocytes. This suggests that the second mechanism in CYN totoxicity, i.e. the generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization, has a higher impact at acute concentrations than the inhibition of protein synthesis which is supported by previous findings in primary mouse hepatocytes.
Moreover, the present data indicate that passive diffusion is indeed a mechanism in the uptake of CYN as the viability of control vector-transfected HEK293 cells was only marginally less reduced than that of the respective OATP transfectants.
The final scope of this study was to analyze cyanobacterial dietary supplements for contaminations with MCs and the excitotoxic amino acid BMAA in order to assess the risk emanating from this potential source of intoxication.
Since BMAA could neither be detected in Spirulina nor Aphanizomenon flos-aquae based supplements these products unlikely constitute a threat with regard to this toxin that has been suggested to be produced by the vast majority of cyanobacteria.
On the contrary, the analyses revealed MCs to be common contaminants of Aphanizomenon flos-aquae containing supplements. All of the samples were tested positively and approximately half of them exceeded the maximal acceptable concentration of 1 µg MCLR equivalents/g dw defined by the Oregon Health Division.
In conclusion, this study provides crucial findings on the toxicity of MCs that might have considerable implications on present risk assessments and guideline values and gives further insight on the uptake and toxicity of CYN. Moreover, it clearly demonstrates that MCs pose a serious health risk for consumers of cyanobacterial dietary supplements based on A. flos-aquae.
Summary in another language
Als Ergebnis ihrer 3,5 - 3,6 Millarden Jahre langen Evolution entwickelten sich Cyanobakterien zu den vielfältigsten und weitverbreitetsten Prokaryoten und eroberten fast jeden erdenklichen Lebensraum auf der ganzen Welt. Während dieser Zeit brachten sie eine enorme Vielfalt an Sekundärmetaboliten hervor, deren physiologische Funktionen weitgehend unerforscht sind. Einige dieser chemisch und strukturell äußerst unterschiedlichen Substanzen erlangten das Interesse der internationalen Forschung, seit ihre Toxizität auf andere Organismen bekannt wurde.
Unter ihnen erregten vor allem die Microcystine (MCs) und seit kürzerem auch die Cylindrospermopsine (CYNs) die größte Aufmerksamkeit aufgrund ihres häufigen und weitverbreiteten Auftretens, sowie zahlreichen, zum Teil tödlichen Vergiftungsfällen von Menschen und Tieren. MCs sind zyklische Heptapeptide, von denen mehr als 80 Kongenere bekannt sind, während CYNs zu den Alkaloiden zählen. Sie bestehen aus einer sulfatierten und methylierten trizyklischen Guanidingruppe, die mit einem Hydroxymethyluracil verbunden ist. Als primärer Wirkmechanismus der Toxizität von MCs stellte sich die starke Hemmung Serin/Threonin-spezifischer Proteinphosphatasen (PPs), insbesondere PP1 and 2A, heraus. Die einzigartige Aminosäure Adda wurde dabei als toxische Komponente innerhalb des MC-Moleküls identifiziert. Isoliertes Adda zeigte hingegen keinerlei hemmende Wirkung auf die Aktivität von PP1. Entsprechende Versuche mit PP2A wurden bisher nicht durchgeführt.
An diese fehlende Information richtete sich der erste Teil der vorliegenden Studie. Wie erwartet rief Adda auch in PP2A keine inhibitorischen Effekte hervor. Dies bestätigt die Annahme, dass die Hemmung von PPs durch MCs, und folglich auch durch die strukturell eng verwandten Nodularine, sowohl Adda, als auch die verbleibenden strukturellen Einheiten des nativen Moleküls benötigt.
Im Gegensatz zu MCs ist der molekulare Wirkmechanismus von CYNs (d.h. die Hemmung der Proteinsynthese und die Bildung eines oder mehrerer toxischer Metabolite durch CYP450) nicht vollständig geklärt. Darüber hinaus existieren keine Informationen über die Wirkung auf humane Primärzellen. Bekanntermaßen gilt die Leber als primäres Zielorgan beider Toxine, wobei zusätzlich auch weitere Organe betroffen sein können. Einige Vertreter aus der Superfamilie der Organic anion transporting polypeptides (OATPs/SLCOs), die in nahezu allen Organen/Geweben nachgewiesen wurden, identifizierte man als mitverantwortlich für die Organverteilung der zellundurchlässigen MCs (genauer gesagt von tritiiertem Dihydro-MCLR und MCLR). Bestehende Versuche deuten darauf hin, dass diese Transporter oder andere Vertreter des Gallensalztransportsystems, neben passiver Diffusion, an der Aufnahme von CYN beteiligt sind.
Aufgrund dessen waren zwei weitere Ziele dieser Doktorarbeit:
die Ermittlung möglicher Unterschiede in der Toxikokinetik (d.h. der aufnahmevermittelten Toxizität) verschiedener MCs (LR, RR, LW and LF) und als Voraussetzung hierfür der Vergleich der Toxikodynamik (d.h. der Hemmung Serin/Threonin-spezifischer PPs) dieser Kongenere
und die Bestimmung der Zytotoxizität von CYN auf primäre humane Hepatozyten und hepatische OATPs exprimierende HEK293-Zellen, um mögliche transportabhängige Effekte zu evaluieren.
Die Experimente ergaben, dass die vier untersuchten MC-Kongenere rekombinante, sowie zelluläre Serin/Threonin-spezifische PPs gleichermaßen wirksam hemmen. Andererseits unterschieden sie sich enorm bezüglich ihrer Zytotoxizität auf OATP exprimierende HEK293-Zellen, als auch primäre humane Hepatozyten.
Demnach weisen diese Ergebnisse stark darauf hin, dass MCs von OATP1B1 und -1B3 mit unterschiedlicher Affinität transportiert werden und führen zu der Annahme, dass die gewaltigen Unterschiede in der in vivo Toxizität von MCs (z.B. MCLR und -RR) eher kongenerspezifischer Toxikokinetik, als Toxikodynamik zugeschrieben werden können.
Darüber hinaus stellten sich primäre humane Hepatozyten im Vergleich zu den entsprechenden mit OATPs transfizierten HEK293-Zellen als um bis zu zwei Größenordnungen anfälliger gegenüber MCs heraus. Diese Feststellung hebt die Bedeutung des Einsatzes von Primärzellen hervor, um physiologisch relevantere Ergebnisse zu erzielen.
Ein weiteres äußerst wichtiges Resultat ist, dass MCLW und -LF sowohl in OATP exprimierenden HEK293-Zellen, als auch in primären humanen Hepatozyten weit höhere Toxizität auslösten als MCLR, das gemeinhin als das toxischste Kongener gilt. Vorausgesetzt dies trifft auch auf die in vivo Toxizität zu, könnte es sein, dass die bestehenden Risikoabschätzungen und Richtwerte überarbeitet werden müssen, da diese ausschließlich auf der Toxizität von MCLR beruhen.
Im Gegensatz dazu stellte sich heraus, dass die OATP assoziierte Toxizität für CYN weit weniger relevant ist, als für MCs. Die Zytotoxizität von CYN schien eher vom Stoffwechselzustand der exponierten Zelltypen abzuhängen, da die immortalisierten und folglich metabolisch weniger aktiven HEK293-Zellen deutlich weniger empfindlich waren, als die primären humanen Hepatozyten. Dies deutet darauf hin, dass der zweite toxische Wirkmechanismus von CYN, also die Bildung eines oder mehrerer toxischer Metabolite durch CYP450, einen größeren Einfluss bei akuten Konzentrationen hat, als die Hemmung der Proteinsynthese. Bekräftigt wird diese Annahme durch frühere Ergebnisse mit primären murinen Hepatozyten.
Des Weiteren weisen die vorliegenden Daten darauf hin, dass passive Diffusion in der Tat ein Aufnahmeweg von CYN ist, da die Lebensfähigkeit kontrollvektortransfizierter HEK293-Zellen, verglichen mit den jeweiligen OATP-Transfektanden, nur geringfügig verringert war.
Das letzte Ziel dieser Doktorarbeit war die Analyse cyanobakterieller Nahrungsergänzungsmittel auf Kontaminationen mit MCs und der exzitotoxischen Aminosäure BMAA, um das Risiko abzuschätzen, das von dieser potentiellen Vergiftungsquelle ausgeht.
Von BMAA wird angenommen, dass es von der überwiegenden Mehrzahl der Cyanobakterien gebildet werden kann. Es konnte jedoch weder in Nahrungsergänzungsmitteln nachgewiesen werden, die auf Spirulina, noch auf Aphanizomenon flos-aquae basieren. Aufgrund dessen geht von diesen Produkten wahrscheinlich keine Gefahr bezüglich BMAA aus.
Hingegen ergaben die Analysen, dass Produkte, die A. flos-aquae enthalten, gemeinhin mit MCs kontaminiert sind. Alle Proben wurden positiv getestet, wobei etwa die Hälfte die maximal akzeptierbare Konzentration von 1 µg MCLR-Äquvalente/g Trockengewicht, festgelegt von der Oregon Health Division, überschritt.
Schlussfolgernd liefert die vorliegende Doktorarbeit äußerst wichtige Ergebnisse über die Toxizität von MCs, die beachtliche Auswirkungen auf bestehende Risikoabschätzungen und Richtwerte haben könnten, und verbessert das Verständnis über die Aufnahme und Toxizität von CYN. Darüber hinaus belegt sie eindeutig, dass MCs ein ernstes Gesundheitsrisiko für Konsumenten von Nahrungsergänzungsmitteln, die auf A. flos-aquae basieren, darstellen.
Unter ihnen erregten vor allem die Microcystine (MCs) und seit kürzerem auch die Cylindrospermopsine (CYNs) die größte Aufmerksamkeit aufgrund ihres häufigen und weitverbreiteten Auftretens, sowie zahlreichen, zum Teil tödlichen Vergiftungsfällen von Menschen und Tieren. MCs sind zyklische Heptapeptide, von denen mehr als 80 Kongenere bekannt sind, während CYNs zu den Alkaloiden zählen. Sie bestehen aus einer sulfatierten und methylierten trizyklischen Guanidingruppe, die mit einem Hydroxymethyluracil verbunden ist. Als primärer Wirkmechanismus der Toxizität von MCs stellte sich die starke Hemmung Serin/Threonin-spezifischer Proteinphosphatasen (PPs), insbesondere PP1 and 2A, heraus. Die einzigartige Aminosäure Adda wurde dabei als toxische Komponente innerhalb des MC-Moleküls identifiziert. Isoliertes Adda zeigte hingegen keinerlei hemmende Wirkung auf die Aktivität von PP1. Entsprechende Versuche mit PP2A wurden bisher nicht durchgeführt.
An diese fehlende Information richtete sich der erste Teil der vorliegenden Studie. Wie erwartet rief Adda auch in PP2A keine inhibitorischen Effekte hervor. Dies bestätigt die Annahme, dass die Hemmung von PPs durch MCs, und folglich auch durch die strukturell eng verwandten Nodularine, sowohl Adda, als auch die verbleibenden strukturellen Einheiten des nativen Moleküls benötigt.
Im Gegensatz zu MCs ist der molekulare Wirkmechanismus von CYNs (d.h. die Hemmung der Proteinsynthese und die Bildung eines oder mehrerer toxischer Metabolite durch CYP450) nicht vollständig geklärt. Darüber hinaus existieren keine Informationen über die Wirkung auf humane Primärzellen. Bekanntermaßen gilt die Leber als primäres Zielorgan beider Toxine, wobei zusätzlich auch weitere Organe betroffen sein können. Einige Vertreter aus der Superfamilie der Organic anion transporting polypeptides (OATPs/SLCOs), die in nahezu allen Organen/Geweben nachgewiesen wurden, identifizierte man als mitverantwortlich für die Organverteilung der zellundurchlässigen MCs (genauer gesagt von tritiiertem Dihydro-MCLR und MCLR). Bestehende Versuche deuten darauf hin, dass diese Transporter oder andere Vertreter des Gallensalztransportsystems, neben passiver Diffusion, an der Aufnahme von CYN beteiligt sind.
Aufgrund dessen waren zwei weitere Ziele dieser Doktorarbeit:
die Ermittlung möglicher Unterschiede in der Toxikokinetik (d.h. der aufnahmevermittelten Toxizität) verschiedener MCs (LR, RR, LW and LF) und als Voraussetzung hierfür der Vergleich der Toxikodynamik (d.h. der Hemmung Serin/Threonin-spezifischer PPs) dieser Kongenere
und die Bestimmung der Zytotoxizität von CYN auf primäre humane Hepatozyten und hepatische OATPs exprimierende HEK293-Zellen, um mögliche transportabhängige Effekte zu evaluieren.
Die Experimente ergaben, dass die vier untersuchten MC-Kongenere rekombinante, sowie zelluläre Serin/Threonin-spezifische PPs gleichermaßen wirksam hemmen. Andererseits unterschieden sie sich enorm bezüglich ihrer Zytotoxizität auf OATP exprimierende HEK293-Zellen, als auch primäre humane Hepatozyten.
Demnach weisen diese Ergebnisse stark darauf hin, dass MCs von OATP1B1 und -1B3 mit unterschiedlicher Affinität transportiert werden und führen zu der Annahme, dass die gewaltigen Unterschiede in der in vivo Toxizität von MCs (z.B. MCLR und -RR) eher kongenerspezifischer Toxikokinetik, als Toxikodynamik zugeschrieben werden können.
Darüber hinaus stellten sich primäre humane Hepatozyten im Vergleich zu den entsprechenden mit OATPs transfizierten HEK293-Zellen als um bis zu zwei Größenordnungen anfälliger gegenüber MCs heraus. Diese Feststellung hebt die Bedeutung des Einsatzes von Primärzellen hervor, um physiologisch relevantere Ergebnisse zu erzielen.
Ein weiteres äußerst wichtiges Resultat ist, dass MCLW und -LF sowohl in OATP exprimierenden HEK293-Zellen, als auch in primären humanen Hepatozyten weit höhere Toxizität auslösten als MCLR, das gemeinhin als das toxischste Kongener gilt. Vorausgesetzt dies trifft auch auf die in vivo Toxizität zu, könnte es sein, dass die bestehenden Risikoabschätzungen und Richtwerte überarbeitet werden müssen, da diese ausschließlich auf der Toxizität von MCLR beruhen.
Im Gegensatz dazu stellte sich heraus, dass die OATP assoziierte Toxizität für CYN weit weniger relevant ist, als für MCs. Die Zytotoxizität von CYN schien eher vom Stoffwechselzustand der exponierten Zelltypen abzuhängen, da die immortalisierten und folglich metabolisch weniger aktiven HEK293-Zellen deutlich weniger empfindlich waren, als die primären humanen Hepatozyten. Dies deutet darauf hin, dass der zweite toxische Wirkmechanismus von CYN, also die Bildung eines oder mehrerer toxischer Metabolite durch CYP450, einen größeren Einfluss bei akuten Konzentrationen hat, als die Hemmung der Proteinsynthese. Bekräftigt wird diese Annahme durch frühere Ergebnisse mit primären murinen Hepatozyten.
Des Weiteren weisen die vorliegenden Daten darauf hin, dass passive Diffusion in der Tat ein Aufnahmeweg von CYN ist, da die Lebensfähigkeit kontrollvektortransfizierter HEK293-Zellen, verglichen mit den jeweiligen OATP-Transfektanden, nur geringfügig verringert war.
Das letzte Ziel dieser Doktorarbeit war die Analyse cyanobakterieller Nahrungsergänzungsmittel auf Kontaminationen mit MCs und der exzitotoxischen Aminosäure BMAA, um das Risiko abzuschätzen, das von dieser potentiellen Vergiftungsquelle ausgeht.
Von BMAA wird angenommen, dass es von der überwiegenden Mehrzahl der Cyanobakterien gebildet werden kann. Es konnte jedoch weder in Nahrungsergänzungsmitteln nachgewiesen werden, die auf Spirulina, noch auf Aphanizomenon flos-aquae basieren. Aufgrund dessen geht von diesen Produkten wahrscheinlich keine Gefahr bezüglich BMAA aus.
Hingegen ergaben die Analysen, dass Produkte, die A. flos-aquae enthalten, gemeinhin mit MCs kontaminiert sind. Alle Proben wurden positiv getestet, wobei etwa die Hälfte die maximal akzeptierbare Konzentration von 1 µg MCLR-Äquvalente/g Trockengewicht, festgelegt von der Oregon Health Division, überschritt.
Schlussfolgernd liefert die vorliegende Doktorarbeit äußerst wichtige Ergebnisse über die Toxizität von MCs, die beachtliche Auswirkungen auf bestehende Risikoabschätzungen und Richtwerte haben könnten, und verbessert das Verständnis über die Aufnahme und Toxizität von CYN. Darüber hinaus belegt sie eindeutig, dass MCs ein ernstes Gesundheitsrisiko für Konsumenten von Nahrungsergänzungsmitteln, die auf A. flos-aquae basieren, darstellen.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
Cylindrospermopsine,Microcystine,Heptapeptide
Conference
Review
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Cite This
ISO 690
FISCHER, Andreas, 2010. In vitro investigations on uptake and toxicity of cyanobacterial toxins [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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They consist of a sulphated and methylated tricyclic guanidino moiety linked to a hydroxymethyluracil.<br />The primary mechanism underlying the toxicity of MCs emerged to be the potent inhibition of serine/threonine-specific PPs, in particular PP1 and 2A. The unique amino acid Adda has thereby been identified as the toxic moiety of the MC molecule. However, isolated Adda was shown to be inhibitory ineffective on PP1 activity. Corresponding effects on PP2A were not determined.<br />Therefore, the first part of this study served to provide the lacking information: As expected, isolated Adda also failed to inhibit the activity of PP2A which corroborates the common assumption that PP inhibition by MCs and, hence, by the structural closely related NODs requires both the Adda moiety and the remaining structural units of the maternal toxins.<br />In contrast to MCs, the molecular mode of action of the geno- and cytotoxic CYNs (i.e. inhibition of protein synthesis and generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization) is not completely understood and no information has so far been provided on its effects in human primary cells.<br />Furthermore, both toxins are known to primarily target the liver, but have been found to additionally affect other organs as well. Some members of the superfamily of organic anion transporting polypeptides (OATPs/SLCOs), that have been found to be expressed in nearly every organ/tissue, have been identified to be jointly responsible for the observed organotropism of the cell impermeant MCs (more precisely tritiated dihydro-MCLR and MCLR). Besides passive diffusion, these carriers or other members of the bile acid transport system have been suggested to also be involved in mediating the uptake of CYN.<br />Therefore, two further aims of the present study were:<br />to assess possible differences in the toxicokinetics (i.e. the uptake-mediated toxicity) of four different MCs (LR, RR, LW and LF) and as a prerequisite to compare the toxicodynamics (i.e. inhibition of serine/threonine-specific PPs) of these congeners<br />and to determine the cytotoxicity of CYN in primary human hepatocytes and liver OATP-expressing HEK293 cells to evaluate possible transport-dependent effects.<br />The experiments revealed that the four MC congeners investigated equipotently inhibit recombinant and cellular serine/threonine-specific PPs, but differed tremendously with regard to cytotoxicity in liver OATP-expressing HEK293 as well as primary human hepatocytes. Hence, these findings strongly suggest that MCs are taken up by OATP1B1 and OATP1B3 with varying affinities and lead to the assumption that the vast differences in the in vivo toxicity of MCs (e.g. MCLR and MCRR) can rather be attributed to congener-specific toxicokinetics than toxicodynamics.<br />In addition, primary hepatocytes appeared to be up to two orders of magnitude more susceptible to MCs induced cytotoxicity than the corresponding HEK293 OATP transfectants which highlights the importance to additionally employ primary cells in order to obtain physiologically more relevant results.<br />A further crucial finding was that MCLW and -LF elicited much higher toxicity in both primary human hepatocytes and OATP-expressing HEK293 cells than MCLR, the congener commonly considered as the most toxic. If this is found to be true for their in vivo toxicities as well, the current risk assessments and guideline values might have to be revised since those are based on MCLR toxicity only.<br />In contrast, OATP-associated toxicity was found to be far less relevant for CYN than for MCs. Cytotoxicity of CYN appeared to rather depend on the metabolic condition of the exposed cell types since the immortalized, hence, metabolically less active, OATP-expressing HEK293 cells were distinctly less susceptible than primary human hepatocytes. This suggests that the second mechanism in CYN totoxicity, i.e. the generation of (a) toxic metabolite(s) by CYP450 metabolization, has a higher impact at acute concentrations than the inhibition of protein synthesis which is supported by previous findings in primary mouse hepatocytes.<br />Moreover, the present data indicate that passive diffusion is indeed a mechanism in the uptake of CYN as the viability of control vector-transfected HEK293 cells was only marginally less reduced than that of the respective OATP transfectants.<br />The final scope of this study was to analyze cyanobacterial dietary supplements for contaminations with MCs and the excitotoxic amino acid BMAA in order to assess the risk emanating from this potential source of intoxication.<br />Since BMAA could neither be detected in Spirulina nor Aphanizomenon flos-aquae based supplements these products unlikely constitute a threat with regard to this toxin that has been suggested to be produced by the vast majority of cyanobacteria.<br />On the contrary, the analyses revealed MCs to be common contaminants of Aphanizomenon flos-aquae containing supplements. All of the samples were tested positively and approximately half of them exceeded the maximal acceptable concentration of 1 µg MCLR equivalents/g dw defined by the Oregon Health Division.<br />In conclusion, this study provides crucial findings on the toxicity of MCs that might have considerable implications on present risk assessments and guideline values and gives further insight on the uptake and toxicity of CYN. Moreover, it clearly demonstrates that MCs pose a serious health risk for consumers of cyanobacterial dietary supplements based on A. flos-aquae.</dcterms:abstract>
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Internal note
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Examination date of dissertation
December 3, 2010