Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden

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BENZ, Armin, 2011. Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden

@phdthesis{Benz2011Artif-10025, title={Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden}, year={2011}, author={Benz, Armin}, address={Konstanz}, school={Universität Konstanz} }

Artificial Q-quadruplexes and identification of novel G-quadruplex ligands deu Benz, Armin Benz, Armin 2011 2011-03-24T18:16:04Z Artifizielle G-Quadruplexe und Identifizierung von neuen G-Quadruplexliganden deposit-license application/pdf G-Quadruplexe sind in vielerlei Hinsicht äußerst interessante Nukleinsäurestrukturen: Auf molekularer Ebene zeigen sie eine faszinierende Anzahl polymorpher Formen, die für innovative nanotechnologische Anwendungen verwendet werden können. Zudem sind genomische G-Quadruplexe an einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Regulation von Transkription und Translation sowie der Stabilität der Telomere beteiligt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, hochaffine und spezifische Liganden für G-Quadruplexe zu identifizieren, um diese für therapeutische Zwecke zu nutzen. G-Quadruplexliganden für die humane Telomersequenz können zum Beispiel die Proliferation von Krebszellen hemmen und sind damit als potentielle Anti-Tumor Agenzien interessant.<br />Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum besseren Verständnis hinsichtlich der Faltung und Stabilität von G-Quadruplexen durch Vergleichsstudien von DNA- mit RNA-Sequenzen zu leisten. Zusätzlich sollten durch den Austausch der natürlichen Guanosin-Grundbausteine gegen Guanosinderivate die Struktur des humanen Telomerquadruplexes programmiert und weitere artifizielle Strukturen erzeugt werden. Abschließend sollten über eine Hochdurchsatz-Durchmusterung neue Klassen von G-Quadruplexliganden aus einer Bibliothek mit niedermolekularen Substanzen identifiziert werden.<br />In der vorliegenden Dissertation wurde eine Vielzahl an DNA- bzw. RNA-G-Quadruplexstrukturen hinsichtlich ihrer Topologie und Stabilität miteinander verglichen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf bekannten DNA-Sequenzen, deren jeweilige RNA-Sequenzen mittels CD-Spektroskopie und CD-Schmelzpunktanalysen untersucht wurden. Im Gegensatz zu den DNA-Sequenzen, welche G-Quadruplexe in unterschiedlichen Topologien ausbilden, falten die RNA-Sequenzen ausschließlich in parallele Strukturen, welche meist eine höhere Stabilität als die entsprechenden DNA-Strukturen aufweisen. Vor allem die thermodynamisch weniger stabilen Sequenzen zeigen eine starke Kaliumionenabhängigkeit, wobei die RNA-Quadruplexe wesentlich stärker als die zugehörigen DNAs stabilisiert werden. Diese Tatsache weist darauf hin, dass die Faltung von G-Quadruplexen an entscheidenden Positionen in mRNAs die Genexpression stärker als bisher vermutet beeinflussen könnte.<br />Weiterhin wurde die Struktur des humanen Telomerquadruplexes (HT-Quadruplex) erstmalig zu einer ausschließlich parallelen bzw. antiparallelen Topologie hin programmiert. Durch gezielten Einbau der Guanosinderivate 8-Oxoguanosin und Xanthosin in die HT-Quadruplexsequenz wird die Ausbildung einer konstruktiven Tetrade mit unverändert vier Wasserstoffbrückenbindungen ermöglicht. Die programmierten Strukturen zeigen im Vergleich zum unmodifizierten G-Quadruplex nur eine unwesentlich geringere Stabilität und könnten somit für die Entwicklung von strukturspezifischen Antikörpern oder niedermolekularen G-Quadruplexliganden dienen.<br />Analog zum Vorgehen bei dem humanen Telomerquadruplex wurde auch die Sequenz eines parallelen G-Quadruplexes modifiziert und die Auswirkungen auf Faltung und Stabilität der Struktur untersucht. Zusätzlich zu einer Tetrade bestehend aus 8-Oxoguanosin und Xanthosin wurde eine Tetrade ausschließlich mit 8-Oxoguanosin konstruiert. Es konnte gezeigt werden, dass dieser artifizielle G-Quadruplex ohne monovalente Kationen eine stabilere Struktur als die unmodifizierte Sequenz bildet.<br />In einem weiteren Teilprojekt der vorliegenden Dissertation sollten neue G-Quadruplexligandklassen mittels Durchmusterung einer Bibliothek niedermolekularer Substanzen identifiziert werden. Hierfür wurde ein Hochdurchsatz-geeignetes Verfahren basierend auf FRET-Messungen mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode wurden aus 34.000 Substanzen drei Liganden des humanen Telomerquadruplexes identifiziert. Neben Berberin, einem bereits bekannten antiproliferativen Wirkstoff, wurden ein chinolinbasierter Zyaninfarbstoff und Carbamid identifiziert. Während alle drei identifizierten Liganden mit EC50-Werten im niederen mikromolaren Bereich sehr hohe Affinitäten zeigen, zeichnen sich Berberin und der Zyaninfarbstoff zusätzlich durch eine hohe Selektivität gegenüber doppelstränger DNA und vergleichbaren Affinitäten aus. Alle drei Liganden können somit als Leitstrukturen für die Entwicklung potenter und spezifischer therapeutischer Wirkstoffe dienen. 2011-03-24T18:16:04Z

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