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Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase

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2004

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Peinelt, Christine

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Kinetics of the SR Ca-ATPase
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Dissertation
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Zusammenfassung

Die Ionenbindung und Freisetzung an der SR-Ca-ATPase wurde in den beiden Hauptkonformationen E1 und P-E2 mittels des Fluoreszenzfarbstoffs 2BITC untersucht. Apparente Bindungskonstanten wurden aus Titrationsexperimenten bestimmt, die absoluten Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten aus Simulationsmodellen.
Die Ergebnisse der Gleichgewichtstitrationen in der E1-Konformation, zeigen die kompetetive Bindung von Ca2+, H+ und Mg2+ an die Bindungsstellen in der Membrandomäne des Proteins. Die apparenten Halbsättigungskonstanten für Ca-Ionen ließen sich in Abwesenheit von Mg-Ionen bei pH 8 zu 34 nM, bei pH 7.2 zu 185 nM und in Anwesenheit von 1 mM Mg2+ und bei pH 7.2 zu 364 nM bestimmen. Der Hill-Koeffizient der Ca2+-Bindung erhöhte sich bei höherer Protonenkonzentration (pH 7.2 gegenüber pH 8) von 1 auf 1.4 und spiegelt eine erhöhte Kooperativität der Bindung wider.
Alle durchgeführten Experimente zur Ionenbindung in E1 ließen sich durch das Schema I (Fig. 34) unter Verwendung eines einzigen Parametersatzes simulieren. Schema I enthält keinen Enzymzustand, in dem sowohl ein Proton als auch ein Ca2+ gebunden sind, und wird als lineares Reaktionsschema bezeichnet. Mit Hilfe von Schema I konnten die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten der Ca2+-Bindung zu K1 = 4x10-8 M und K2 = 5x10-8 M, die der Mg2+-Bindung zu K3 = 5x10-5 M und K4 = 5x10-3 M und die der H+-Bindung zu K6 = 10-8 M, K7 = 10-8 M, K8 = 10-6 M und K9 = 10-5 M bestimmt werden. Mit diesen Parametern konnten die experimentellen Daten sehr gut beschrieben werden. Sie stimmen weitgehend mit den apparenten Konstanten überein.
Durch die Zugabe von ATP und in Anwesenheit von 1 mM Mg2+ und 14 µM Ca2+ befindet sich das Enzym vorwiegend in der P-E2 Konformation.
Die Ionenbindung an das Enzym im E2-P-Zustand konnte nur durch ein Schema simuliert werden, in dem ein Zustand mit einbezogen wurde, in dem ein Proton und ein Ca2+ gebunden sind (Schema IIb, Fig. 36). Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante der Ionenbindung betrug für die Bindung des ersten Protons K3 = K3* = 2x10-6 M (pK 5.7). Die Affinität für das zweite Proton betrug K4 = 10-5 M (pK 5). Die Halbsättigungskonstanten für das erste Ca2+ wurde auf K2 = K2* = 4x10-4 M festgesetzt und die des zweiten Ca2+ auf K1 = 2.5x10-2 M. Die Bindung des ersten Protons, bzw. Ca2+ wurde hierbei unabhängig von der Bindung der jeweiligen anderen Ionenspezies gewählt.
Zeitaufgelöste Kinetiken der Partialreaktionen wurden untersucht, indem ATP und Ca2+ aus ihren caged Komponenten durch Laserblitze freigesetzt wurden.
Nach der sprunghaften Freisetzung von ATP konnte eine ansteigende und eine abfallende Phase der Fluoreszenz von 2 BITC beobachtet werden, welche der Ca2+ Freisetzung bzw. Protonenbindung in P-E2 zugeordnet wurden. Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der ansteigenden Phase wurden für niedrige pH-Werte dem Reaktionsschritt (Ca2)E1P -> P-E2(Ca2) mit 33 ± 2 s-1 zugeordnet und für hohe pH Werte der Freisetzung des ATP. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der fallenden Phase wurde für hohe pH-Werte als P-E2* -> P-E2 mit 0.4 ± 0.2 s-1 bestimmt und für pH < 6 mit 1.1 ± 0.1 s-1. Das Standard-Post-Albers-Schema musste um diesen zusätzlichen Schritt erweitert werden.
Um die cytoplasmatischen Ionenbindungs- und freisetzungsschritte zu untersuchen, wurden Ca-Konzentrationssprungexperimente durchgeführt, in denen Ca2+ aus caged Ca freigesetzt wurde. Dabei wurde eine Abnahme der 2BITC-Fluoreszenz beobachtet. Es konnten eine schnelle und eine langsame Komponente mit t1 (mit 2 ms < t1 < 8 ms) und t2 (mit 50 ms < t2 < 200 ms) aufgelöst werden. t1 besitzt eine ähnliche pH-Abhängigkeit wie t2. Hierbei konnte durch die Analyse des einfachen Reaktionsschemas ausgeschlossen werden, dass die pH-Abhängigkeit durch die Bindung eines Protons in den Ca2+-Bindungsstellen zustande kommt. Die pH-Abhängigkeit lässt sich möglicherweise durch eine allosterische Bindung eines Protons an einen der drei Aspartatreste (Asp813, Asp815, Asp817) im Loop L67 erklären. Das Aspartat müsste erst deprotoniert werden, bevor das jeweilige Ca2+ auf dem Weg in die Bindungsstelle vorübergehend an den Loop binden kann. Die Annahme des gleichen Mechanismus für die Sequenzen steht nicht im Widerspruch zu den signifikant verschiedenen Aktivierungsenergien (t1: EA ~ 30 - 50 kJ/mol und t2: EA ~ 60 - 70 kJ/mol), da davon ausgegangen werden kann, dass die Membrandomäne des Enzyms im Zustand CaE1 unbeweglicher ist als im unbesetzten E1-Zustand, z.B. durch eine Koordination des ersten Ca2+ in der Ionenbindungsstelle mit einer Aminosäure der Helix M6.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Ion binding and release steps of the SR Ca-ATPase were investigated in both main conformations E1 and P-E2 with the fluorescent styryl dye 2BITC. The apparent binding constants were determined by titration experiments, the absolute equilibrium dissociation constants by mathematical simulation models.
The results of the equilibrium titration experiment show electrogenic binding of Ca2+, H+, and Mg2+ ions in the membrane domain of the protein.
The half saturating concentration of of Ca2+ in the absence of Mg2+ and at pH 8 is 34 nM and raised up to 185 nM at pH 7.2 and to 364 nM at pH 7.2 in presence of 1 mM Mg2+.
The Hill coefficient increased from 1 (pH 8) up to 1.4 (pH 7.2) and showed an enhanced cooperativity of the ion binding. All experiments performed could be simulated by scheme I (Fig. 34) and the same set of parameters. Scheme I contained no mixed state in which a proton and a Ca2+ are bound at the same time (a so-called linear scheme).
By application of scheme I to the experiments the equilibrium dissociation constants could be determined to K1 = 4x10-8 M and K2 = 5x10-8 M (Ca2+), K3 = 5x10-5 M and K4 = 5x10-3 M (Mg2+), and K6 = 10-8 M, K7 = 10-8 M, K8 = 10-6 M and K9 = 10-5 M (H+). With this set of parameters all experimental data can be described and they are consistent with the apparent binding constants.
By addition of ATP in the presence of 1 mM Mg2+ and 14 µM Ca2+ the enzyme proceeds to the state P-E2. Ion binding to the E2-P state could be simulated only by an ion binding scheme containing a mixed state in which a Ca2+ and a H+ are bound at the same time (Schema IIb, Fig. 36). The equilibrium dissociation constants were K3 = K3* = 2x10-6 M (pK 5.7) (first proton), K4 = 10-5 M (pK 5) (second proton), K2 = K2* = 4x10-4 M (first Ca2+) and K1 = 2.5x10-2 M (second Ca2+). Binding of the first H+ and the first Ca2+ was not dependent on the binding of the respective other ion species.
Time-resolved kinetics of different partial reactions were investigated by laser-flash induced increase of ATP from its inactive precursor caged ATP. The fluorescence signal of 2BITC showed an initial rising and subsequent falling phase which were assigned to the release of Ca2+ and binding of protons, respectively.
The rate-limiting step of the rising phase is (Ca2)E1P -> P-E2(Ca2), 33 ± 2 s-1 at low pH. The interesting pH range is limited to pH 7.5 above which release of ATP becomes slow. The rate-limiting step of the falling phase is an additional conformation relaxation, P-E2* -> P-E2 with a time constant of 0.4 ± 0.2 s-1 pH > 6 and 1.1 ± .1 s-1 pH < 6. The standard Post-Albers scheme had to be expanded by this additional step.
In order to study cytoplasmic ion-binding and release steps Ca2+ concentration-jump experiments were performed in which Ca2+ was released by a laser flash from caged Ca. A fluorescence decrease was observed with a fast and a slow phase. Two processes could be identified with time constants t1 (2 ms < t1 < 8 ms) and t2 (50 ms < t2 < 200 ms). In the presence of saturating Ca2+ concentration ([Ca2+] > 100 nM) both processes were controlled by Ca2+-independent reaction steps which were similarly pH dependent . A competition of protons and Ca2+ could be ruled out.
The dependence of the time constants on pH can be explained, however, by binding of a proton to an allosteric site on the loop L67 (Asp813, Asp815, Asp817). In such a case at least one aspartate residue has to be deprotonated before a Ca2+ can be bound transiently prior its entry into the binding site within the membrane domain. This is not inconsistent with the different activation energies of both reaction steps that determine the time constants (t1: EA ~ 30 - 50 kJ/mol and t2: EA ~ 60 - 70 kJ/mol), because the membrane domain of the state CaE1 is expected to be less flexible than in the E1 state, e.g. by a coordination of the first Ca2+ with a residue of the M6 helix, which takes part in the binding of both Ca2+.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie

Schlagwörter

SR Ca-ATPase, Caged components, Kinetics, Fluorescent Styryldye

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ISO 690PEINELT, Christine, 2004. Kinetische Untersuchungen der SR-Ca-ATPase [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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November 19, 2004
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