Monitoring developmental toxicity in vitro, by using mouse and human embryonic stem cells

Abstract

Die Europaeische Kommission publizierte die zukuenftige Chemikalienpolitik mit dem Titel Weissbuch: Strategie fuer eine zukuenftige Chemikalienpolitik . Um die Gefahren, die von Chemikalien ausgehen, die in Mengen zwischen einer und zehn Tonnen produziert werden, zu identifizieren, benoetigt die neue Chmikalienpolitik in vitro Methoden. Entwicklungstoxikologie ist ein Feld, in dem sehr grosse Mengen an Tieren fuer toxikolosche Studien verbraucht werden. Um Interspezies-Variationen in Entwicklungsstudien auszuschliessen, ist die Anwendung humaner embryonaler Stammzellen ein Muss. In dieser Studie wurden murine embryonale Stammzellen benutzt, um ein System zu entwickeln, dass in der Lage ist, teratogene Effekte von Substanzen auf Herzzellen sowie Osteoblasten zu detektieren, welche aus ES Zellen differenziert wurden. Zusaetzlich wurde dieses Maussystem eingesetzt, um durch Chemikalien verursachte wachstumsverzoegernde Effekte zu entdecken. Weiterhin wurde die Kapazitaet von humanen ES Zellen in funktionelle Kardiomyozyten zu differenzieren untersucht. Die murine Kardio-ES-Zelldifferenzierung wurde anhand der Gene Oct-4, Brachyury, Nkx2.5 and alpha-MHC untesucht, welche mit Hilfe von RT-PCR gemessen wurden. RA zeigte schon in der nicht zytotoxischen Konzentration einen Effekt auf die fruehe mesodermale Entwicklung anhand einer modifizierten Brachyury Expression. Zusaetzlich konnten wir eine starke Inhibition der kardialen Entwicklung anhand der verminderten Expression der Gene Nkx2.5 und alpha-MHC feststellen. Die Effekte auf die kardiale ES-Zellspezifikation wurden auch anhand der Verminderung der Aktivitaet von schlagenden Herzzellen identifiziert. Die Einwirkung von LiCl fuehrte zu einer verminderten kardiale Differenzierung. Eine reduzierte Expression kardiospezifischer Gene konnte beobachtet werden. Die murinen ES Zellen wurden waehrend der Kardio- und Osteoblastendifferenzierung mit Methotrexat (MTX) in der nicht zytotoxischen Konzentration behandelt. Die Expression von Schluesselgenen, die an der Kardiomyozytendifferenzierung und Osteoblastendifferenzierung beteiligt sind, wurden mit Hilfe von RT-PCR untersucht. Moegliche Effekte von MTX auf das EB-Wachstum wurden mit Hilfe von digital Image Analysis untersucht. Die MTX Behandlung resultierte nicht in einer veraenderten kardialen Genexpression. Eine verminderte Expression der Osteoblasten spezifischenen Gene konnte beobachtet werden. Da die Oct-4 und Brachyury Expression unveraendert blieb, konnte die spezifische Teratogenitaet von MTX auf die Knochenbildung bestaetigt werden. Die Kardiomyozytendifferenzierung der humanen ES Zellinie H1 wurde mit Hilfe von realtime PCR verfolgt. Viele humane Gene, die an der Kardiodifferenzierung beteiligt sind wurden analysiert. Um die Kardiomyozytenausbeute zu optimieren, wurden die ES Zellen in Kulturmedien mit verschiedenen Zusammensetzungen kultiviert. Zudem wurde mittels Genexpression die Entwicklung von Ectoderm und Endoderm untersucht. Die humanen ES Zellen zeigten die Faehigkeit, sich in alle drei Keimblaetter waehrend der in vitro Differenzierung entwickeln zu koennen. Die maximale Expression der mesodermspezifischen Gene wurde mit 20% Kaelberserum enthaltendem Medium erreicht. Die Kardiospezifikation erfolgte, deren Gene von Tag 18 bis Tag 25 der Differenzierung maximal exprimiert wurden. Heutzutage gibt es keine in vitro Systeme, die in der Lage sind, verzoegertes Wachstum festzustellen. Aus diesem Grund wurde ein System, das auf digital Image Analysis beruht, entwickelt. Das murine EB-Wachstum wurde ueber zehn Tage der Differenzierung beobachtet. Um die Verlaesslichkeit des Testes zu testen, wurden drei Substanzen Boric Acid (BA), 6-Amminonicotinamid (6-AN) und 5-Fluorouracil (5-FU) getestet, da sie verzoegertes Wachstum in vivo zu induzieren. Zusaetzlich wurde MTX als unbekannte Substanz und Saccharin (SAC) als negative Kontrolle getestet. Die IC-50 Werte der Wachstumsverzoegerung wurden mit denen des MTT-Testes verglichen. Die Effekte der Substanzen auf adultes Gewebe (Fibroblasten BALB/3T3) wurden zusaetzlich untersucht. Die Resultate demonstrieren einen signifikanten Unterschied zwischen genereller Zytotoxizitaet und spezifischen Effekten auf das EB-Wachstum fuer BA, 6-AN und 5-FU. Dieses Ergebnis bestaetigt die in vivo Daten und die Faehigkeit dieser Substanzen verzoegertes Wachstum hervorzurufen.MTX hat keinen Einfluss auf das EB-Wachstum, d.h. es konnten keine statistischen Unterschiede zwischen den IC-50 Werten festgestellt werden. Es liegen keine Literaturangaben vor, um diese Ergebnisse zu bestaetigen. Zieht man die verschiedenen Manifestationen der Entwicklungstoxikologie in Betracht, kann nur eine in vitro Testbatterie die noetigen Informationen fuer regulatorische entwicklungstoxikologische Zwecke liefern. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass die Verwendung von ES Zellen ein leistungsfaehiges Instrument darstellt, um in vitro Systeme zu entwickeln.